此稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数。即可选择该稀释倍数进行正式干扰实验。
当系列浓度中所有浓度的供试品管都不为阴性，或供试品阳性对照不为阳性时，说明供试品对内毒素与鲎试剂的反应存在干扰，则应对供试品进行更大倍数稀释（不得超过MV
D=CL/λ0.03），或通过气压适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。
当供试品的内毒素限值单位为EU/mg或EU/U活性单位时，应将最小不干扰稀释倍数换算成最大不干扰浓度（即该稀释倍数下溶液的浓度），以mg/ml或活性单位/ml表示。 4.2.2.4 举例
例：设某注射液限值为2.5EU/ml，按MV D=CL/λ计算出灵敏度为0.03EU/ml下的MV D为80倍，将供试品溶液稀释一系列检验，用灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂进行预实验。结
果如下
稀释倍数原液510204080
供试品溶液－－－－－－－－－－－－ 供试品阳性对照－－－－－－＋＋＋＋＋＋
如上结果可初步确定该样品的最小不干扰稀释倍数为20倍，可在此浓度下进行正式干扰实验。 4.2.3 正式干扰实验
目的是检验在某一浓度下的供试品对于鲎试剂与内毒素的反应有无干扰作用。使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过所使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。 4.2.3.1 制备内毒素标准对照溶液
取1支细菌内毒素标准品，用细菌内毒素检查用水稀释成4个浓度的标准溶液即2.0λ、λ、0.5λ、0.25λ，（方法同4.1.1.1）。
4.2.3.2 制备含内毒素的供试品溶液
4.2.3.2.1 将供试品稀释至预实验中确定的不干扰稀释倍数，再用此稀释液将4.2.3.1中的同支细菌内毒素标准品稀释成4个浓度即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的含内毒素
的供试品溶液。
以注射用头孢哌酮钠（1g/瓶为例：取10ml检查用水溶解注射用头孢哌酮钠即为100mg/ml，设需将其稀释20倍（5mg/ml）后备用。（注：冻干品或无菌粉末用检查用水溶解后
体积有无变化，根据具体情况定）。
取一支细菌内毒素标准品，加入1m检查用水溶解，然后取内毒素标准溶液0.3ml制备内毒素标准对照溶液；再取内毒素标准溶液0.3ml加上2.7ml的5mg/ml头孢哌酮钠溶液，即
为含10倍内毒素稀释液的供试品溶液，取0.3ml含10倍内毒素稀释液的供试品加上2.7ml的5mg/ml头孢哌酮钠溶液，即为含100倍内毒素稀释液的供试品溶液。其余依次类推。 4.2.3.2.2 简化法制备含内毒素的供试品溶液：
0.5ml浓度为1.0EU/ml的内毒素标准溶液＋0.5ml浓度为10mg/ml的供试品溶液 得到1ml的含0.5EU/ml内毒素的浓度为5mg/ml的供试品液。
同理分别用0.5ml浓度为0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml的内毒素标准溶液制备含0.25 EU/ml 、0.125 EU/ml 和0.0625m EU/ml 内毒素的浓度为5g/ml的供试品系列溶
液。（其体积的大小视情况而定）。 4.2.3.3 鲎试剂的准备
取规格为0.1ml/支的鲎试剂36支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解，轻
轻转动瓶壁，使内容物充分溶解，避免产生气泡。若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，按其标示量加入检查用水复溶，将复溶后的鲎试剂溶液混和在一起，然后每0.1ml分
装到10×75mm凝集管中，要求至少分装36管备用。 4.2.3.4 加样
将准备好的鲎试剂18支（管）放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准
对照液，另一列2支（管）加入0.1ml检查用水作为阴性对照。
将另外18支（管）鲎试剂放在试管架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分别加入0.1ml的2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ的内毒素的含供试
品溶液；另一列2支（管）加入0.1ml供试品溶液作为样品阴性对照。
加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生气泡，两同试管架放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，保温60±2分钟后，观察并记录结果。
4.2.4 实验结果计算
如两组最大浓度2.0λ均为阳性，最低浓度0.25λ均为阴性，阴性对照4管均为阴性时，按下式计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（ES）和用
供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的几何平均（Et）。 ES=lg-1(∑XS/4) Et=lg-1(∑Xt/4) 式中
XS ,Xt分别为用检查用水和供试品溶液或稀释液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。 4.2.3 当ES在0.5λ-2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，且Et在0.5 ES～52.0 ES（包括0.5 ES和2.0 ES）时，则认为供试品在该浓度下不干扰试验，可在该浓度下对此供试品
进行细菌内毒素检查。
当ES不在0.5λ-2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，则认为供试品在该浓度下干扰实验。应使用适宜的方法排除干扰，如对供试品进行更大倍数稀释，是排除干扰因素的简单有效
方法。建立新品种细菌内毒素检查方法时，每个厂家至少取三个批号（不包括亚批）的供试品，用两个以上鲎试剂生产厂家的鲎试剂进行干扰实验。 4.2.5 举例
设供试品为某注射液，预实验中初步确定其最小不干扰稀释倍数为20倍，使用灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂检测供试品是否对内毒素检查存在干扰。
内毒素浓度（EU/ml）0.25 0.125 0.0625 0.03 Nc反应终点浓度 1 内毒素标准浓度 2 3
4 ＋ ＋ ＋ － － ＋ ＋ ＋ － － ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ －0.0625 0.0625 0.0625
0.0625 1 含供试品的 2 内毒素溶液 3
4＋ ＋ － － － ＋ ＋ － － － ＋ ＋ － － ＋ ＋ － －0.125 0.125 0.125 0.125
ES=lg-1(∑XS/4)
= lg-1[(lg0.0625＋lg0.125＋lg0.0625＋lg0.0625)/4] =0.125（EU/ml） Et=lg-1(∑Xt/4)
= lg-1[(lg0.125＋lg0.125＋lg0.125＋lg0.125)/4] =0.125 （EU/ml）
Et在0.5 ES～2.0 ES范围内，说明该供试品进行20倍稀释后确已排除干扰作用，在低于或等于此浓度的情况下即可使用细菌内毒素检查法。 4.3 供试品细菌内毒素检查凝胶限度试验
在细菌内毒素检查中，每批供试品必须做2支供试品管和2支供试品阳性对照，同时每次实验必须做2支阳性对照和2支阴性对照。 4.3.1 操作方法
4.3.1.1 供试品溶液的制备
首先计算MV D=C?L/λ、L的意义同1.3。λ为所使用鲎试剂的标示灵敏度。然后将供试品进行稀释，其稀释倍数不得超过MV D。 4.3.1.2 阳性对照溶液的制备
用检查用水将内毒素标准品稀释制成2λ浓度的内毒素标准液。 （方法同4.1.1.1）。
4.3.1.3 供试品阳性对照溶液的制备
用待检测的供试品溶液或其稀释液将内毒素标准品制成2λ浓度的内毒素溶液。 （方法同4.2.1.3.2供试品阳性对照溶液的制备）。 4.3.1.4 阴性对照液即细菌内毒素检查用水 4.3.1.5 鲎试剂的准备
取规格为0.1ml/支的鲎试剂8支，轻弹瓶壁使粉末落入瓶底，用轮在瓶颈轻轻划痕，75%棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落入瓶内。每支加入0.1ml检查用水溶解、轻轻转动瓶
壁，使内溶物充分溶解，避免产生气泡。若使用的鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，取若干支，按其标示量加入检查用水复溶，充分溶解后将鲎试剂溶液混和在一起，然后每
0.1ml分装到10×75mm凝集管中，要求至少分装8管备用。
4.3.1.6 加样 取8支（管）溶解好的鲎试剂，其中2支加入0.1ml供试品溶液或其稀释液（其稀释液不得超过MV D）作为供试品管，2支加入0.1ml阳性对照溶液作为阳性对照
管（PC），2支加入0.1ml检查用水作为阴性对照管，（NC），2支加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品阳性对照管（PPC）。
4.3.1.7 将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，保温60±2分钟。保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 4.3.2结果判断
当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性且阴性对照都为阴性时，实验方为有效。若供试品管2管均为阴性，认为该供试品符合规定；如供试品2管均为阳性，应认为不符
合规定；如2管中1管为阳性，1管为阴性，按上述方法另取4支供试品管复试，4管中如有1管为阳性，即认为不符合规定。若第一次实验时供试品的稀释倍数小于MV D而结果出
现2管均为阳性或2管中1管为阳性时，按同样方法复试，复试时要求将其稀释至MV D。 4.3.3 举例
供试品为葡萄糖注射液，其内毒素限值为0.5EU/ml，设所用鲎试剂的灵敏度为0.125EU/ml， MV D=C?L/λ=0.5/0.125=4
将样品进行4倍稀释，并做4倍稀释下的供试品阳性对照。