供试品
供试品阳性对照 阳性对照 阴性对照
－－＋＋＋＋－－ 结果是否有效有效
结果判断该批葡萄糖注射液的内毒素含量小于0.5EU/ml，符合规定 4.4 凝胶半定量实验
半定量实验是使用凝胶法估测供试品中内毒素含量的方法。系利用供试品系列与鲎试剂反应的终点浓度计算出供试品中内毒素的含量。 4.4.1 操作方法
4.4.1.1 供试品系列的制备
用检查用水将供试品溶液从已确定的不干扰浓度或稀释倍数下开始进行对倍稀释，制备成2、4、8等N个浓度，但最大稀释倍数不得超过MV D。N可根据实验设计不同确定。 4.4.1.2 内毒素标准系列的制备
用检查用水将内毒素标准品稀释成4个浓度的标准溶液即2.0λ、1λ、0.5λ、0.25λ，（方法同4.1.1.1）。 4.4.1.3 供试品阳性对照溶液的制备
用已确定不干扰浓度或稀释倍数的供试品溶液将内毒素标准品制成2λ浓度的内毒素溶液。（方法同4.2.1.3.2供试品阳性对照溶液的制备）。
4.4.1.4 阴性对照液即细菌内毒素检查用水。 4.4.1.5 鲎试剂的准备
取规格为0.1ml/支或分装好的鲎试剂12＋2N支，其他准备按正式干扰实验项下的“鲎试剂准备”。 4.4.1.6 将准备好的鲎试剂取其中10支（管）放在试管架上，排成5列，每列2支。其中4列每列每支分别加入0.1ml的2.0λ、λ、0.5λ、0.25λ的内毒素标准溶液，另一列2
支（管）加入0.1ml检查用水作为阴性对照。
将另外2N支（管）鲎试剂放在试管架上，排成N列，每列2支（管）。每列每支分别加入0.1ml一个浓度的供试品溶液。
另2支（管）加入0.1ml供试品阳性对照溶液作为供试品的阳性对照。
4.4.1.7 将试管中溶液轻轻混匀后，用封口膜封闭管口，垂直放入37℃±1℃水浴或适宜恒温器中，保温60±2
分钟。保温和取放试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。 4.4.2 实验结果计算
如内毒素标准系列最大浓度2λ均为阳性，最低浓度0.25λ均为阴性，阴性对照为阴性恭试品阳性对照为阳性时，按下式计算内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（λ
t）和供试品系列溶液反应终点浓度的几何平均值（CE）。 λt=lg-1(∑Xt/2) CE=lg-1(∑X/2)
式中 Xt为内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（lg）。
X为供试品溶液的反应终点浓度的对数值（lg），反应终点浓度为供试品溶液每一系列平行管的终点，稀释倍数乘以标志灵敏λ。 4.4.3 结果判断
当λt在0.5λ～2λ之间，试验方为有效。供试品的内毒素含量即为CE。
如果实验检验的是供试品的稀释液，则计算原始溶液内毒素浓度时要将结果乘以稀释倍数。
如果试验中供试品溶液的结果都为阴性，应记为内毒素浓度小于λ（如果检验的是稀释过的供试品，则记录为小于λ×该供试品的最小稀释倍数）。如果结果都为阳性，应记为
内毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。
若内毒素浓度小于规定的限值，判供试品符合规定。若内毒素浓度大于或等于规定的限值，判供试品不符合规定。 4.4.4 举例
设供试品为某注射液，干扰实验已确定其最小不干扰稀释倍数为20倍，其内毒素限值为10EU/ml，现使用灵敏度为0.03EU/ml的鲎试剂检测供试品中的内毒素含量。 MV D=C?L/λ=10/0.03≈320倍
将供试品溶液先稀释至20倍后，再进行对倍稀释。将20倍稀释液稀释2、4、8、16倍，同时制备内毒素标准系列。
内毒素浓度（EU/ml）0.0625 0.03 0.015 0.0075 Nc反应终点浓度 内毒素标准溶液
＋ － － － － ＋ － － － －0.0625
0.0625
供试品稀释倍数 1 2 4 8 16 PPC反应终点稀释倍数 供试品系列 ＋ ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ － － ＋8 4
λt=lg-1(∑Xt/2)
=lg-1 [（lg0.0625＋lg0.0625）/2] =0.0625（EU/ml） CE=lg-1(∑X/2)
=lg-1 [lg（8×0.03）＋lg（4×0.03）]/2 =0.170EU/ml
供试品20倍稀释液的内毒素含量=0.170EU/ml
由于供试品先被稀释了20倍，因此供试品的内毒素含量为0.170×20=3.40EU/ml，低于规定的内毒素限值，此批注射液内毒素检查项符合规定。 5 光度测定法操作方法
光度测定法分为浊度法和显色基质法。
浊度法系利用检测鲎试剂与被毒素反应过程中的浊度变化而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，可分为终点浊度法和动态浊度法。终点浊度法是依据反应混合物中的内毒素
浓度和其在孵育终止时的浊度（吸光度或透光率）之间存在着量化关系来测定内毒素含量的方法。动态浊度法是检测反应混合物的浊度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应
时间，或是检测浊度增加速度的方法。
显色基质法系列用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产生的凝固酶使特殊底物显色释放出的有色团的多少而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，分为终点显色法和动态
显色法。终点显色法是依据反应混合物中的内毒素浓度和其在孵育终止时释放出的有色团的量之间存在的量化关系来测定内毒素含量的方法。动态显色法是检测反应混合物的色
度到达某一预先设定的吸光度所需要的反应时间，或是检测色度增长速度的方法。 5.1 仪器的设置
浊度法分为终点浊度法和动态浊度法，显色基质法也分为终点显色法和动态显色法。针对不同的方法，在配置相应的测定仪器。
在实验来势前，应根据仪器的说明和实验的设计设定反应时间，反应温度（一般为37℃±1℃），检测波长等相关系数。
供试品和鲎试剂的分装加样量、供试品和鲎试剂的比例以及保温时间等，需参照所用仪器和试剂的有关说明进行。
5.2 标准曲线的可靠性试验
当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能会影响检验结果的改变时，需进行标准曲线的可靠性试验。
5.2.1 实验操作
5.2.1.1 细菌内毒素标准溶液的制备
用检查用水将一支内毒素标准品溶解稀释，并制成至少3个浓度的稀释液（相邻浓度间稀释倍数不得大于10），如10、1、0.1EU/ml或0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03EU/ml
，但最低浓度不得低于所用鲎试剂的标示检测限。稀释操作方法同凝胶法。 5.2.1.2 鲎试剂的准备
要求内毒素标准系列中每一浓度至少做3支平行管，并要求同时做2支阴性对照。根据所制备的标准曲线中浓度的个数来计算所需要的鲎试剂体积。
由于凝胶法鲎试剂和光度测定法鲎试剂在工艺上有所不同，因此在进行光度法检测时需使用专用鲎试剂而不能用凝胶法鲎试剂代替。光度法鲎试剂都为0.5ml以上装量，在溶解
后需将所有鲎试剂混合在一起，备用。 5.2.1.3 加样
将标准内毒素溶液和阴性对照按仪器要求的体积分装到仪器配置的反应容器中，如小试管或微孔板。再加入要求体积的鲎试剂，轻轻混匀，避免产生气泡，然后将反应容器放入
光度测定仪中进行反应。 5.2.2 结果判断
当阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，将全部数据进行线性回归分析。
根据线性回归分析，标准曲线的相关系数（r）的绝对值应大于或等于0.980，试验方为有效。否则须重新试验。
5.3 干扰实验
干扰实验的目的同凝胶法干扰实验。当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰实验。 5.3.1 实验操作 5.3.1.1 标准曲线的制备 操作同5.2.1.1。
5.3.1.2 将供试品进行一系列的稀释，但不得超过MV D。选择标准曲线中点或一和靠近中点的一和内毒素浓度，设为λm，作为添加到供试品中的标准内毒素浓度。可按如下方
法制备供试品每一稀释倍数下的样品阳性对照：
如使用的标准曲线为50、5、0.5、0.05EU/ml的标准系列，选择0.5EU/ml浓度作为λm。现需制备稀释倍数为4的供试品阳性对照液。可取0.3ml浓度为1.0EU/ml的内毒素标准
液＋0.3ml稀释倍数为2的供试品稀释液 制得0.6ml含0.5EU/ml内毒素标准的稀释倍数为4的供试品稀释液。
也可按仪器或试剂厂商提供的其他方法配制。 5.3.1.3 鲎试剂的准备 同5.2.1.2 5.3.1.4 加样
标准曲线每个浓度不小于2支平行管，供试品每个浓度不少于2支平行管，同时供试品每个浓度的样品阳性对照也不少于2支平行管。并用检查用水做2支阴性对照。
将标准内毒素溶液、供试品、供试品阳性对照和阴性对照按仪器要求的体积分装到仪器配置的反应容器中，再将鲎试剂也按要求的体积加入到反应容器中，轻轻混匀，避免产生
气泡，然后将反应容器放入光度测定仪中进行反应。 5.3.2 实验结果计算
当反应完毕后，仪器自动生成标准曲线并按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量Ct和Cs，按下式计算供试品每一浓度的回收率
（R）。
R=（Cs－Ct）/λm×100%