处；5?聚乙烯小管??[HT5SS]梯度混合装置如图13-6，由A和B管组成。两管之间用双通活塞联结。在活塞]关闭的状态下，向A管中加入低浓度蔗糖溶液，向B管中加入高浓度的蔗糖溶液，两管中容量要相等。在B管出口处用一根聚乙烯小管连接到离心管。在给B管充液时，可将聚乙烯小管的流出口向上转动，使之超过液体的水平面，从而阻止液体流出。充液后可将小管接到离心管中使之贴着管壁，然后开动小搅拌器，使搅拌棒转动，同时打开两管间活塞。这三个操作要同时进行，以保证梯度的连续性。当梯度液体自B管流出时不允许移动离心管，待离心管中所盛的梯度溶液的体积达到需要量之后，将离心管小心地静止于4℃1～2小时，以平衡之。 现在不少“制备用超速离心机”携带有“密度梯度制备自动装置”。按照这个方法制备的蔗糖浓度梯度，理论上按下式计算：?[JZ]C=C?A-(C?A-C?B)(1-V)??-b/a??A管和B管的横断面积各为a、b，其中所含蔗糖浓度分别为C?A、C?B，两液开始混合以]后流出Vml时流出液的浓度为C。A和B管的横断面积一般情况下相等，故a=b，这时获得的梯度为直线梯度。如果a≠b时，离心管中浓度梯度产生凸形和凹形梯度曲线。这些浓度梯度是根据样品和实验目的而专门选用的。一般使用的浓度梯度范围为20%→5%，40%→10%，或60%→10%等。?
(2)加入样品：用如上所述注射器或微量吸管吸取悬浮于适宜缓冲液中的病毒或核酸样品(约梯度介质体积的1/10容量)，从液面上方1mm处，紧贴着离心管壁轻轻层加于梯度介质面上。?
(3)高速或超速离心：将加入样品的离心管装入套管内，也可将离心管置于转头的套管内，以免在装进套管时震动液体。拧紧套管螺帽，将套管吊在水平转头上，置于离心机内。梯度离心一般用高速或超速离心机。离心速度和时间，根据所分离的样品选定。离心开始，样品中各种粒子逐渐分离，分布于相应的密度梯度层中成为带状(如为透明的聚碳酸酯离心管，则可以清楚地见到带状分离，并拍照)。离心时间到时，使离心机自然停止，不许制动，以免破坏梯度。?
(4)梯度的分段收集(取样)：在离心完了以后，为了把已分离物质的各条带分开，必须取出梯度溶液。梯度溶液的分段收集方法有如下几种。?
①取代法：从离心管底部穿刺或将带长针头的注射器插入离心管底，使一种稠密]的介质，如60%～70%(W/V)蔗糖溶液，缓慢地注入于离心管底部。然后用一个注射器或移液管，从上面逐一移出各部分。或者在离心管的颈部加上一个塞子，这个塞子附着一根收集导管，通向一个部分收集器，收取各部分。?
②穿刺法：将离心管固定于特制的固定架上，在其底部装上一个垂直向上的空心针穿刺，使梯度溶液自由滴出，可用部分收集器或用小试管分段收集。超速离心机一般都带有此装置。此装置的缺点是离心管在用一次后即废弃。? ③虹吸法：此法的优点是不必穿刺离心管，离心管可反复使用。经多次试证实，此法简]便易行，对梯度密度无破坏。用一根大穿刺针截两段做虹吸管，以接上50～100ml玻璃注射器进行送气的方法，分段收集梯度溶液。?????[HT5”SS][JZ]图13-7〓从分部密度梯度中的分部收集?[HT5”SS][GK4]从分部密度梯度中的分部收集A、B部分由有机玻璃制成，并利用螺帽C]紧密地装在一起，利用O形垫圈封起来。通过注入浓蔗糖溶液使管内成分缓缓向上挤入锥形]收集中而流出??[HK] [HT5SS] ④注射器吸取法：用弯曲的针头(J状)接在注射器上，从梯度最上层开始向]下逐层小心吸取液体。? 6.梯度各层液体的密度测定?
(1)称重量法：用10ul微量注射器吸取样品，加入于已知重量的毛细管中，在1/10万分析天秤上称重，计算重量(g/ml)，即为梯度溶液的密度。?
(2)测定折射率法：用阿贝氏折光仪测定各梯度层溶液的折射率(25℃)，然后按照前述的公式ρ??25?=a?ｎ??25??D-b 换算成密度(g/ml)。?
(3)浮漂法：向已制备好的各种密度溶液中滴入一滴样品，找出相应的样品浮密度溶液，即为该梯度层的密度。? 7.各梯度分层液中病毒分布的鉴定?
(1)以紫外分光光度计测定蛋白质和核酸吸收峰。吸取各层梯度溶液，用蒸馏水或缓冲液适当稀释后，测定波长280和260nm的OD值。然后以各梯度层管号为横坐标，其OD值为纵坐标画曲线，即为各梯度层中蛋白质?病毒含量图，有些病毒260nm]OD值较高。?
(2)以各种血清学方法测定各梯度层中病毒的抗原效价；或用组织培养法测定病毒滴度，证实病毒分布区域。? (3)用电子显微镜负染法观察病毒粒子及其纯度。将各梯度层样品装入透析袋中，置于适宜的溶液中透析去盐，然后取一滴样品用蒸馏水稀释，滴附于铜网膜上，用磷钨酸负染后电镜下观察病毒粒子。
1) （4 M KCl and 50 mM Tris-HCl, pH7.2）：（病毒悬液）=1：3； 2) 或者，直接加KCl到病毒悬液中，终浓度为1M； 3) 轻晃混匀，冰上放置15-30分钟 4) 离心12,000 g 10分钟4°C，收集上清 5) 分装-80保存