Ⅲ）72℃ 8min Ⅳ）4℃ 保存
（3）将PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并拍照记录实验结果。
2.2.3胶回收adk基因片段和连接T载体及大肠杆菌的培养
1）胶回收adk基因片段
按照提供的普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒—-离心柱型中所述的方法对已检测
并可使用的adk基因片段进行回收
1.柱平衡步骤：向吸附柱CA2中加入500ul平衡液BL,12000rpm(～13400×g)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
2.将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量。 3.向胶块中加入3倍体积溶胶液PN，因为凝胶重为0.1g，其体积可视为100ul，以此类推。50℃水浴放置10分钟，期间不断温和的上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
4.将上一步所得溶液加入另一个吸附柱CA2中室温放置2分钟，12000rpm（～13400×g）离心30～60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
5.向吸附柱CA2中加入700ul漂洗液PW，12000rpm（～13400×g）离心30～60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。
6.向吸附柱CA2中加入500ul漂洗液PW，12000rpm（～13400×g）离心30～60秒，倒掉收集管中的废液。
7.将吸附柱CA2放入收集管中，12000rpm（～13400×g）离心2分钟，尽量出去漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底晾干。
8.将吸附柱CA2放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30ul洗脱缓冲液EB，水浴37℃2分钟。12000rpm（～13400×g）离心2分钟收集DNA溶液。
2) 连接T载体
1.在200ulEP管中加入下列组分： PMD-19TVector 0.5ul Insert DNA 4.5ul Solution Ⅰ 5 ul 2.轻轻混匀，16℃连接30分钟
3）大肠杆菌摇床培养
部分同学在老师指导下已完成
2.2.4 DNA的提取及大肠杆菌感受态细胞的制备
1）DNA的提取
1、向10ml离心管中预先加入4mlCTAB抽提液及相应量的β-巯基乙醇（2%-3%），65℃预热；
2、取适量的植物甘薯嫩叶用液氮充分磨成粉末，转入该10ml离心管中，迅速混匀。
3、于65℃水浴45min，中途间隔（轻柔）颠倒混匀三次或四次； 4、冷至室温后加入等体积(4ml)氯仿，轻柔颠倒混匀使乳化10min； 5、10000转／分离心10min（18-20℃）； 6、吸取上清3-4ml于另一干净的10ml离心管中；
7、吸取上清加入与上清液等体积且已于-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温放置15分钟至白色絮状沉淀出现；
8、用玻璃钩子挑出DNA，放入盛有1ml 75%乙醇的1.5ml Eppendorf管中 9、用75%乙醇中漂洗DNA沉淀，用Tip头吸干乙醇； 10、用1ml 75%乙醇再漂洗一次； 11、用无水乙醇再漂洗一次；
12、沉淀于室温或60℃以下的恒温箱中干燥片刻至刚出现半透明； 13、用500μl TE溶解沉淀，可用65℃水浴助溶，得DNA粗提物。 14、取10μl DNA电泳检查DNA的质量； 2）大肠杆菌感受态细胞的制备
1.将1ml过夜培养菌液移入50mlLB培养基中，37℃震荡培养至OD值为0.3-0.6 2.取培养液3 ml转入10ml无菌离心管中，于4℃4000r／min离心10min，去上清
3.沉淀用3ml预冷的0.1MCaCl2悬浮，与冰上放置30分钟； 4. 4℃，4000r／min离心10min，去上清；
5.沉淀用600μl冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞 6.分装3管，每管200μl ，冰上放置30分钟
2.2.5连接产物的转化、筛选及PCR检测
1.将10μl DNA的连接物加入一管感受态细胞中，混匀后放置冰上30分种； 2.42℃水浴中热激恰恰90sec，迅速取出立即放于冰上2min，室温下放置3-5min； 3.加入800 ?l 37℃预热的LB液体培养基，混匀后37℃ 180 rpm培养0.5h 4.4000 rpm离心10min，去800 ?l 上清液，将剩余的200 ?l 菌液混匀； 5.用烧烤过的涂布棒将100?l的菌液涂布于加相应抗生素的LB固体培养基涂匀，共2个
6.置于37℃恒温箱中培养
2.2.6 连接产物的筛选及PCR检测
1.选取平板上合适菌落，标记备用（共4个）
2.用10μl移液器枪头对准所选菌落刮取，置于装有1ml溶液的EP管中 3.将EP管进行摇床培养 4，PCR检测
3.实验结果与分析
3.1甘薯RNA的提取及检测+反转录
（初） 图1-1 总RNA的电泳图
图1-2 总RNA的电泳图（末）
结果分析：RNA极易被RNA酶降解，而RNA酶在自然界中广泛而丰富的存在，因此要取得本次实验的成功关键之处在于严格防止RNA酶的污染。此外，为了达到更佳的效果，实验选用的材料是甘薯嫩叶，因为其RNA含量丰富，但实验中能否研磨充分，也会对实验结果造成影响。从RNA电泳的结果来看，我们组在该次实验中较好地做到了这两点，因此获得的条带不仅区分度好，亮度也高。
在实验中共进行了两次紫外检测，首次检测是在预期时间后，但发现RNA条带跑的不是很开（如图1-1），分析原因是配制琼脂糖凝胶时胶浓度比期望浓度大，致使RNA迁移速率减慢，因而电泳时间相对延长。由于在电场中核酸分子的迁移速率取决于分子量大小和空间构型，沉降系数大的RNA跑得慢，故从上到下的条带分别代表28S、18S、5.8S（如图1-2）。从电泳获得的28S和18S两条主带的亮度来看，28S和18S RNA比值约为2:1，符合一般真核细胞RNA比值。
3.2PCR扩增adk基因核心片段
图2 PCR扩增adk基因的电泳图
结果分析：上次实验中，我们对获得的甘薯RNA进行了反转录，获得cDNA。本次实验利用上次实验获得的cDNA进行PCR，所用的10×PCR buffer、taq是北京普博欣公司生产，而引物1、引物2系华大公司生产（1、2组），其他四组用其他公司生产的试剂盒。从扩增结果来看，效果均不错（1-4组扩增的是adk基因，5、6组扩增的是adk核心片段，故结果有所差异）。通过与Marker跑出的条带对比，扩增的目的基因在1000~750 bp之间（Marker各条带从上到下分别表示2000、1000、750、500、250、100，后面3个不太明显）。
本次实验每个组共做了2个50 μL反应体系，但待加完所有试剂后，很多体系的体积明显不同，分析原因可能是在操作过程中使用移液枪出现问题，或是移液枪本身有误差。
3.3目的基因片段的回收、连接
上次实验我们扩增到了甘薯adk目的基因，并进行了电泳，得到了单一目的DNA
条带，本次实验将该目的DNA条带切下，进行胶回收和T载体连接。实验进行顺利。根据时间安排，本次连接过夜，是连接更加完全。
3.4DNA的提取、大肠杆菌感受态细胞的制备、连接产物的转化 3.4.1DNA的提取
图4-1 提取DNA结果图
图4-2 提取DNA的电泳图
结果分析：本次提取DNA使用的材料仍是甘薯，所用植物材料的量和研磨是否充分是影响获得DNA量多少的两个主要方面，与其他组相比，我们组提取的DNA量比较充足（如图4-1所示）。将此DNA沉淀溶解后进行琼脂糖凝胶电泳，得到3条清晰可区分的带，从上向下依次代表蛋白质等大分子杂质、DNA、RNA（如图4-2所示），较其他组而言，我们组DNA条带亮度高，说明提取的DNA量多。RNA分带不明显，说明有部分降解，但未被降解完全。
3.5连接产物的筛选及PCR检测
图5-1 连接转化后的E.Coli平板
图5-2 PCR菌检图