肿瘤治疗的新思路：抗血管生成与肿瘤血管正常化
南通大学附属医院消化内科 毛振彪
肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长阶段转变为有血管的快速增殖阶段，血管生成使肿瘤能够获得足够的营养物质，是促成上述转变的关键环节。如果没有血管生成，原发肿瘤的生长不会超过 1~2 mm3。肿瘤侵袭转移是肿瘤治疗失败的主要原因，而在肿瘤发生侵袭转移的多步骤过程中，血管生成均发挥着重要作用。与传统的抗癌治疗相比，抗血管生成治疗具有许多优点：（1）正常成年人的血管形成基本停止，内皮细胞常处于不分裂状态，只有在妊娠、月经周期、炎症、外伤和肿瘤等特殊情况，血管形成才被启动，因此，抗血管生成治疗对正常内皮细胞影响不大，具有良好的特异性；（2）血管内皮细胞暴露在血液中，药物能够直接发挥作用，无需渗透 Endostatin，所用药物剂量小、疗效高；（3）血管内皮细胞基因表达相对稳定，不易产生耐药；（4）作用具有放大效应，因为一个内皮细胞支持 50~100个肿瘤细胞生长。
一、抗肿瘤血管生成治疗的发展历史
1907年，Goldman发现血管围绕着肿瘤生长，提出肿瘤的生长依赖邻近的毛细血管。1968年，有学者提出肿瘤能产生弥散性血管生成物质促进新血管的生成。1971年，Folkman首次提出肿瘤生长和转移是血管依赖性的，阻断肿瘤血管生成是遏止肿瘤生长的有效策略。1987年，Folkman和他的同事从肿瘤细胞中分离出第一个血管生成因子即成纤维细胞生长因子。这激起了科学家对促血管生成因子（pro-angiogenesis factor）与血管生成抑制因子（anti-angiogenesis factor）的积极探索。贝伐单抗（Avastin）于2004年2月获美国FDA批准用于临床。2005年9月重组人血管内皮抑素（恩度）得到SFDA的批准。自此，抗血管生成治疗的理论由实验室走入临床。
二、肿瘤血管生成的调控
Folkman 曾提出在肿瘤发生和发展过程中的存在\血管生成开关机制\，揭示了肿瘤微血管形成的分子机制。在肿瘤生长的最初阶段，并不是所有的实体瘤都具备血管生成表型，但随着肿瘤细胞不断分裂增殖，那些伴有癌基因或抑癌基因突变并具备了血管生成表型的肿瘤细胞逐渐增殖形成优势，它们通过多个途径诱导周围组织新生血管形成。 肿瘤的血管生成及微环境的异常是由于局部微环境中促血管生成因子和血管生成抑制因子之间的调节失衡。这一过程不仅涉及促血管生成因子分泌增加，而且内源性血管生成抑制因子产生相应减少。血管生成因子包括：血管内皮细胞生长因子（VEGF）、酸性及碱性成纤维细胞生长因子（aFGF，bFGF）、转化生长因子（TGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、表皮生长因子（EGF）、血管生成素（angiogenin）等；内源性血管生成抑制因子主要包括：血管抑素（angiostatin）、内皮抑素（endostatin）、凝血酶敏感蛋白
（TSP-1）、金属蛋白酶抑制剂（TIMP）、血小板因子 4（PF4）、可溶性 VEGF 受体（sFlt-1）、可溶性酪氨酸激酶受体（sTie-2）等。
VEGF/VEGFR通路是肿瘤血管生成的主要信号通路。血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）家族成员包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PIGF 。VEGF，也称VEGF-A，是生理和病理性血管生成最重要的刺激因子。VEGF作用有：维持内皮细胞的存活，诱导内皮细胞增殖和迁移，募集骨髓源性造血祖或干细胞诱导血管形成，增强血管通透性。VEGF-A有两种酪氨酸激酶受体，即VEGFR-1（Flt-1）和VEGFR-2（KDR/Flk-1）。VEGFR-2是VEGF发挥促血管生成效应的主要受体。多种肿瘤细胞和宿主细胞如血小板、肌细胞、基质细胞都能产生VEGF。缺氧是VEGF表达上调重要的诱导因素。促进VEGF的分泌的其它因素有：低pH值，生长因子，炎症趋化因子，基因突变。
另一个重要的酪氨酸激酶受体通路是由血管内皮细胞表达的tie-2介导的，其配体是angiopoietin-1（Ang-1）和angiopoietin-2（Ang-2）。Ang-1是激动剂而Ang-2是拮抗剂，angiopoietin与VEGF结合能够使毛细血管稳定和成熟[9]。
血管生成调节因子是肿瘤血管治疗的重要靶分子，通过阻断血管生成促进因子的作用途径或增强血管生成抑制因子的活性来达到治疗肿瘤的目的。
四、肿瘤血管的正常化对于肿瘤治疗的重要性
传统观点认为，抗肿瘤血管生成治疗通过引起肿瘤缺血缺氧而饿死肿瘤，然而，抗血管生成药物使肿瘤血管严重退化，可阻碍药物和氧的传输而拮抗化疗和放疗的抗瘤效果。这与抗血管生成联合放疗和化疗能提高疗效的事实相矛盾。Jain对此提出了一个有悖于传统观点的解释，即肿瘤血管正常化的理论：由于肿瘤的血管分布存在异质性，肿瘤细胞的供血必然不均匀，部分肿瘤细胞处于缺氧状态，对化疗药物敏感性下降，这一特点限制了抗肿瘤化疗药物的疗效。最有效的抗肿瘤化疗要使得每一个肿瘤细胞都能充分接触细胞毒性药物并且产生最大的细胞毒效应。肿瘤血管的正常化，理论上就可以改善肿瘤血管壁的结构及其外周细胞的功能，有能力抵御肿瘤细胞的侵袭。这些积极意义可以体现在抗血管生成治疗联合化疗后，肿瘤患者的临床预后得到改善。同样，抗血管生成治疗联合放疗也会增强放疗的抗肿瘤作用。肿瘤微环境趋向正常化后，肿瘤间质压力下降，驱使肿瘤细胞淋巴转移的动力因素解除，使肿瘤患者能够得到临床获益。
抗血管生成治疗后能产生一个特定的“时间窗”，这时肿瘤血管出现短暂的正常化，与放化疗联合治疗能产生协同作用。优化联合抗血管生成药物与放化疗的治疗方案需要明确血管开始正常化到结束的正常化时间窗。正常化时间窗是短暂而可逆的，并且与肿瘤类型、部位相关。Tong等比较了DC10（VEGFR-2特异性抗体）、γ射线放疗及二者联合使用对神经胶质母细胞荷瘤鼠的作用，结果发现在DC101处理后4-6天产生了正常化时间窗，这时与放疗联合产生了最佳效果。
在正常组织中，内源性的促血管生成因子和血管生成抑制因子维持平衡。在肿瘤内，促血管生成因子的过量表达或血管生成抑制因子的下调引起肿瘤血管和微环境的异常。
Jain提出，如果合理使用抗血管生成药物重新恢复促血管生成因子和血管生成抑制因子间的平衡，就可使肿瘤的血管系统趋于正常。如果血管抑制因子占优势会使血管退化乃至肿瘤消退。这种动态变化机理尚未阐明。血管正常化和过度退化间精细的平衡就更强调抗血管生成药物最佳剂量和给药时间选择。对肿瘤血管正常化机制的研究将为联合细胞毒性治疗的正常化时间窗口提供策略。
Wink等研究发现肿瘤血管正常化同时伴随着Ang-1的上调和基质金属蛋白酶的激活。DC101通过短暂地激活Ang-1/VEGFR2通路上调Ang-1的表达增加周细胞募集到肿瘤血管，使肿瘤血管直径下降，通过激活Tie2增加肿瘤的氧合，并能通过基质金属蛋白酶的激活降低基底膜的病理性增厚。Ang-1上调使肿瘤内间质压力和渗透性下降。另外，DC101能引起肿瘤内Ang-2的表达下降。Ang-2能使血管变得不稳定，Ang-2表达的下调使血管变得更稳定。一氧化氮（NO）是参与肿瘤的病理生理和血管生成过程的气体介质。在肿瘤和正常组织中，血管内皮细胞起源的NO参与血管生成，并促使周细胞的募集和血管的稳定。NO介导多种血管生成因子的功能，如VEGF、Ang-1，也能诱导内源性血管生成因子如VEGF、b-FGF的表达。Kashiwagi等发现，在神经胶质母细胞荷瘤鼠模型中，通过神经元型一氧化氮合酶（neuronal NO synthase，NOS1）靶序列的短发夹RNA沉默NOS1 基因或抑制肿瘤细胞NOS1的方法消除其产生的NO，产生跨血管的NO梯度，可使肿瘤血管正常化，改善乏氧状况，增强肿瘤细胞对放疗的敏感性。这提示跨血管NO梯度的产生可能是使异常的血管正常化的有效策略。
然而，Hamzah等提出了不是通过抗血管生成药物而是靶向G蛋白信号转导通路来逆转肿瘤血管的新机制。这证明了肿瘤血管生成的下降是基于肿瘤血管基因的缺失，以及G蛋白信号转导通路在肿瘤血管生成中的作用。G蛋白信号转导调控因子5（Rgs5）是小鼠肿瘤血管形态异常的主导基因。Rgs5 基因功能缺失使肿瘤血管和微环境在形态和功能方面发生正常化改变，提高抗瘤效果。Rgs5 基因缺失使肿瘤内周细胞表型改变和成熟，却不增加周细胞数量。
五、靶向肿瘤血管生成药物与血管正常化的临床前和临床治疗研究 （一）单克隆抗体-贝伐单抗
罗氏公司研发的贝伐单抗（Avastin）是一种抗 VEGF 的人源化抗体（IgG1）， 93%的人源结构域和 7%由的鼠源结合区域组成，是全世界第一个被批准用于抑制血管生长的单克隆抗体药物，2004 年 2 月得到美国食品和药品管理局（FDA）的批准。Avastin 联合 5- 氟尿嘧啶为基础的化疗用于一线治疗晚期结直肠癌患者，明显延长患者生存期。2007 年 ASCO 会议报道 IFL 方案（伊立体康、 5- 氟尿嘧啶和亚叶酸）加 Avastin IV 期大规模 AVIRI5临床试验，结果显示结直肠癌中位存活期和无进展生存期明显延长。Avastin 除了与化疗药物联用外，2010年 ASCO 会议报道 Avastin 联合靶向 EGFR 的单克隆抗体 Cetuximab （西妥昔单抗）可以安全有效地治疗化疗失败的晚期转移性结直肠癌。
贝伐单抗除了能直接抗血管生成，也能使肿瘤血管正常化。Willett等对局部晚期的直肠癌患者进行术前新辅助放化疗的I期临床扩大试验。治疗方案为贝伐单抗（5 mg/kg，每2周一次）1周期后，再联合5-FU方案与放疗治疗3个周期，7-9周后进行手术。这个试验通过影像学技术（CT灌注成像技术、PET），检测血循环中的内皮祖/干细胞和内皮细胞、血浆中的VEGF等血管生成因子、组织IFP，来评价个体的疗效。结果发现，术前肿瘤明显缩小，肉眼未见肿瘤。贝伐单抗能够修剪肿瘤血管，使残留的肿瘤血管在结构和功能上出现正常化。贝伐单抗治疗后第12天肿瘤血容量、血管密度下降，周细胞覆盖血管的比率增加，IFP降低了。放射活性示踪剂的摄取却没有同时下降而相当于正常水平，这提示残留的正常化的血管更有效输送药物到肿瘤实质。
AZD2171是一种口服的多种VEGFR TKI，也能抑制PDGFR和c-kit的活性。Batchelor等目前正在开展AZD2171治疗胶质母细胞瘤患者的Ⅱ期临床试验。该试验运用MRI灌注成像分析、检测循环内皮祖细胞及内皮细胞、血浆中的血管生成因子蛋白水平等方法，结果发现通过每日口服AZD2171能使肿瘤血管正常化，并能减轻脑水肿，与历史对照相比延长了无进展生存期和总生存期。血管正常化时间窗能快速地启动，持续时间长，用MRI定量分析测得是从口服AZD2171后的第1-112天，此时是联合化疗和放疗的最佳时期。
（二）化学抑制剂
1.内皮抑素（endostar，恩度）
1997 年，Reilly 等从小鼠血管内皮瘤（EOMA）细胞培养液中提取出一种血管生成抑制剂--血管内皮抑制素（Endostatin，ES），简称内皮抑素，目前被认为是作用最强、效果最好、最广谱的肿瘤血管生成抑制剂。其作用机制是通过抑制形成血管的内皮细胞迁移而抑制肿瘤新生血管的生成，阻断肿瘤的营养供给，从而抑制肿瘤增殖或转移。它能阻断内皮上的a5p1整合蛋白（Integfin，它是血管生成中的细胞黏附分子），并通过阻断内皮细胞选择素显示其抗血管生成活性；另外也能阻断金属蛋白酶2，9和13的活性，是多重的血管生成抑制剂。
恩度不是单纯的 Endostatin，是在 ES 母体上创造性的添加了 9 个氨基酸的新型 Endostatin，不仅使ES 稳定性提高，半衰期延长，而且生物活性增加。与国外 Endostatin 样品相比，恩度的纯度明显增加，这也是恩度的剂量只有国外十分之一左右的原因。2006 年 Folkman 教授在动物试验上的研究证实，恩度抑瘤效果至少是 Endostatin 的两倍。
体内实验表明，本品对鼠肿瘤模型显示了广谱的抑瘤活性（S180肉瘤、H22肝癌），并有抗人异种移植肿瘤（SPC—A4肺腺癌、SGC7901胃癌、Hela宫颈癌、SMMC-7721和Be17402肝癌）的活性。
我国科学家首次将重组人内皮抑素（endostar，商品名：恩度）开发成抗肿瘤药物，2003 年 4 月～2004 年 7 月由中国工程院院士孙燕教授牵头，中国医学科学院肿瘤医院联合全国 24 家临床医院，对恩度进行了 493 例晚期 NSCLC 患者Ⅲ期临床实验，结果显示，恩度联合长春瑞滨与顺铂具有协同作用，能明显提高晚期非小细胞肺癌的生存率，延长中位肿瘤进展时间，且安全性好。2005 年 9 月，恩度获得中国国家药品监督管理局签发的新药证书。本品常见不良反应（1％ <发生率<10％）主要有心脏不良反应，主要症状有窦性心动过速、轻度ST-T改变、房室传导阻滞、房性早搏、偶发室性早搏等，常见于冠心病、高血压病史患者。临床应用过程中，应定期检测心电图和心肌标志物。
邢士超等报道了恩度联合国产吉西他滨二线治疗了15例晚期胰腺癌的结果，在可评价的14例患者中, PR 1例，SD 4例，PD 9例，,即DCR 3517%， CBR 4010%，并且耐受性良好。王成龙等对48例晚期胃癌应用恩度联合OLF方案与单纯OLF方案化疗进行了比较，结果显示联合化疗组有效率较单纯化疗组提高（5010% vs. 4515%，P < 0105），而两组的TTP和OS未得出统计学差异。刘秀峰等应用恩度联合化疗治疗晚期胃癌9例，其中联合FOLFOX4方案作为二线治疗的有2例均获得了PR，其余3例为三线或以上的治疗,获得2例SD，1例PD，QOL均得以改善,生存期有所延长。最近，江丰收等将42例Ⅳ期复治胃癌患者随机分为2组，试验组20例给予恩度联合XELOX方案治疗，对照组22例仅给予XELOX方案治疗，2组患者均至少接受2个周期的化疗。结果显示,试验组和对照组RR分别为4010%和2217%（ P < 0105），CBR 分别为7510%和5911%（ P <0105） ，中位TTP分别为619个月和319个月（ P < 0105） 。2组患者治疗后QOL 评分均有所提高,以试验组提高更明显（ P < 0105）。2组患者治疗后血清VEGF水平均有不同程度的下降,以试验组下降较为明显( P < 0105) 。2组患者不良反应发生率相似。提示恩度联合XELOX方案治疗晚期胃癌安全有效、耐受良好，值得临床推广应用。 2.TNP-470（烟曲霉素衍生物）
TNP-470 是烟曲霉素（fumagillin）的半合成类似物，抑制内皮细胞的增殖、游走及血管形成的作用较后者更强，毒性也低。该药与吉西他滨或顺铂联合使用，Ⅲ期临床用于宫颈癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌和肺癌等实体瘤治疗显示出了明显的抗肿瘤活性。 （三）多靶点酶抑制剂 1.索拉非尼
索拉非尼（sorafenib，多吉美）是一种双芳基尿素类口服多激酶抑制剂，它具有双重抗肿瘤作用，一方面通过抑制 Raf/MEK/ERK 信号传导通路直接抑制肿瘤生长，另一方面通过抑制几种与新生血管生成和肿瘤发展有关的酪氨酸激酶受体的活性，包括 VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-β 和 c-KIT 原癌基因，阻断肿瘤新生血管生成，间接抑制肿瘤细胞的生长。2005 年 12 月 20 日获美国 FDA 批准上市，是近十多年来世界上被批准的治疗晚期肾癌的第一个新药，是晚期肾癌治疗的重大进展。2006 年 9 月，Sorafenib在中国经