牢固。所以从由先到后的洗脱顺序是 a, e ,b ,c ,d。
18、为什么在凝胶过滤层析时，分子量小的蛋白质有较长的保留时间，而在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它又跑得最快？
答：凝胶过滤常用的是葡聚糖凝胶(Sephadex)，这种凝胶颗粒的交联介质排阻分子量较大的蛋白质，仅允许分子量较小的蛋白质进入颗粒内部，所以分子量较大的蛋白质只能在凝胶颗粒之间的空隙中通过。这意味着它通过柱的体积为床体积减去凝胶颗粒本身所占的体积。而分子量小的蛋白质必须通过所有的床体积才能流出，所以，分子量小的蛋白质比分子量大的蛋白质有较长的保留时间。而SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其凝胶介质并不存在象凝胶过滤中Sephadex那样的颗粒之间的空隙。所以，所有的蛋白质分子必须通过交链介质而移动。蛋白质的分子量越小，通过介质就越快，移动得越迅速。
19.一种分子量为24,000、pI为5.5的酶被一种分子量类似、但pI为7.0的蛋白质和另外一种分子量为100,000、pI为5.4的蛋白质污染。提出一种纯化该酶的方案。
答：用凝胶过滤(即分子排阻层析)法先除去分子量为100,000、pI为5.4的蛋白质，余留7、下来的低分子量的含酶的混合物再用离子交换层析法分离，于是就能获得所需要的纯酶。 20.凝胶过滤层析中的分子筛效应与SDS-PAGE中的分子筛效应有什么异同点？ 答：相同点：根据生物大分子的分子量大小进行分离。
不同点：二者作用机制不同，凝胶过滤层析主要依靠分子筛效应，即大分子物质经凝胶间隙被洗脱，而小分子物质由于进入了凝胶颗粒内部，洗脱时走的路径较长，故而在凝胶中能保留较长的时间，中等大小的分子由于进入凝胶颗粒的程度不同，按照分子量由大到小的顺序先后洗脱。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳时，蛋白质所带电荷性质被SDS所掩盖，SDS-蛋白质复合物变成雪茄状，其短轴均相同，而长轴与分子量大小成正比，在电泳时，SDS-蛋白质复合物的迁移率与其形状有关，分子量小的迁移较快。 21、影响电泳时带电颗粒泳动度的主要因素有哪些？它们是分别如何影响的？ 答：（1）首先决定于带电颗粒的性质，即颗粒所带净电荷的数量，大小及形状。一般说来，颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快，反之则慢。 （2）电场强度。一般电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。
（3）溶液的pH值。溶液的pH值决定了带电颗粒解离的程度，也决定了物质所带净电荷的多少，对于蛋白质，氨基酸等两性电解质而言，溶液pH值离等电点越远，颗粒所带净电荷越多；电泳速度越快；反之则越慢。
（4）溶液的离子强度。溶液的离子强度越高，带电颗粒泳动速度越慢，反之越快。
（5）电渗作用。电渗是指在电场中液体对固体支持物的相对移动。在电场中，若带负电荷颗粒向正极移动，而介质却向阴极移动，从而对颗粒的泳动起阻碍作用；反之加快。
（6）支持物。对支持物的一般要求是均匀，吸附力和电渗小，机械性能好，便于染色或紫外光下检测，故最好透明，无紫外吸收。支持物性质不同也会影响泳动速率，如琼脂与聚丙烯酰胺凝胶都有大小不同的筛孔，在筛孔大的凝胶中溶质颗粒的泳动速率快，反之则慢。
22、某无四级结构的蛋白质用凝胶过滤法测定的表观分子量是90kD；用SDS-PAGE测定时，它的表观分子量是60kD，无论β-巯基乙醇是否存在。哪种测定方法更准确？为什么？
答：蛋白质的分子形状影响它在凝胶过滤时的行为。分子形状较长的蛋白质在凝胶过滤时具有类似于分子较大的蛋白的行为。用SDS-PAGE测定的蛋白质分子量应该是比较准确的，因为变形后的蛋白质的迁移速度只取决于它的分子大小。
23、请根据下面的信息确定蛋白质的亚基组成：① 用凝胶过滤测定，分子量是200kD；②用SDS-PAGE测定，分子量是100kD；③在β-巯基乙醇存在下用SDS-PAGE测定，分子量是40kD和60kD。
答：答：凝胶过滤法分离的蛋白质是处在未变性的状态，如果被测定的蛋白质的分子形状是相同的或者是相似的，所测定的分子量应该是较准确的。在没有β-巯基乙醇存在下，SDS-PAGE测定蛋白质的分子量只是根据它们的大小。但这种方法能破坏寡聚蛋白质亚基间的非共价作用力，使亚基解离。在这种情况下，所测定的是亚基的分子量。如果有β-巯基乙醇存在，则能破坏肽链内或肽链间的二硫键。在这种情况下
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进行SDS-PAGE，所测定的分子量是亚基的分子量或者是肽链的分子量（如果亚基是由二硫键连接的几个肽链组成）。根据题中给出的信息，该蛋白质的分子量是200kD，由两个大小相同的亚基（100kD）组成，每个亚基由两条肽链（40kD和60kD）借二硫键连接而成。
24、离子交换剂由哪几部分组成？何为阳离子交换剂，何为阴离子交换剂？
答：离子交换剂是由基质、电荷基团(或功能基团)和反离子构成的，基质与电荷基团以共价键连接，电荷基团与反离子以离子键结合。阳离子交换剂的电荷基团带负电，反离子带正电，电荷基团可以与溶液中带正电荷的化合物或阳离子进行交换反应。阴离子交换剂的电荷基团带正电，反离子带负电。因此，电荷基团可以与溶液中的负电荷化合物或阴离子进行交换反应。 25、当含有下列性质的蛋白质混合物：
①相对分子质量12000 PI=10 ②相对分子质量62000 PI=4
③相对分子质量28000 PI=7 ④相对分子质量9000 PI=5 若不考虑其他因素，问：
A.当它们流经DEAE-纤维素（阴离子交换纤维素）时，用线性盐浓度梯度洗脱时，这些蛋白质被洗脱的顺序如何？为什么？
B.当它们流经Sephadex G-50凝胶层析柱时，这些蛋白质被洗脱的顺序如何？为什么？
答：①③④②。当pH>pI时，被分离物带一定数量的阳离子，等电点越高，则其阳离子数越多，与阴离子交换树脂的结合越弱，故最先被洗脱。②③①④。相对分子质量越大，流经凝胶柱时洗脱体积小， 最先被洗脱。
26.在色谱操作过程中为什么要进行平衡？
答：1、流速平衡：流速是柱层析操作当中的主要影响因素，流速的快慢直接影响着分离的效果，流速过快，混合物得不到完全的分离，流速过慢，整体分离的时间要延长，因此在分离前首先要确定留宿。2、液体环境：为了保持被分离物质运动的均一性，以及好的吸附和解析效果，因此要保持孔隙内部和外部液体环境的一致，所以进行液体环境的平衡。
27．以羧酸吸附蛋白质为例，简要说明离子交换树脂的洗脱方法及其原理？
答：1、加碱：主要是调节蛋白质到达等电点，是蛋白质带电量减少，吸附力下降从而被洗脱下来。2、加酸：主要是抑制羧酸的电离，使活性基团带电量下降，吸附力下降从而蛋白质被洗脱下来。3、加盐：依照质量作用定律，把蛋白质洗脱下来。
28．在离子交换色谱操作中，怎样选择离子交换树脂？
答：1、对阴阳离子交换树脂的选择：正电荷选择阳离子交换树脂，负电荷选择阴离子交换树脂。2、对离子交换树脂强弱的选择：较强的酸性或碱性，选择选用弱酸性或弱碱性树脂。3、对离子交换树脂离子型的选择：根据分离的目的，弱酸或弱碱性树脂不使用H或OH型。 29．简述盐析的原理及产生的现象？
答：当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：（1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度增大。（2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降，原因如下：（a）无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢；（b）中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀； 30.简述吸附色谱分离技术的原理？
答: 利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力(范德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键)的差异而实现分离
31.怎样进行离子交换树脂的预处理及转型？
答：物理处理：水洗、过筛，去杂，以获得粒度均匀的树脂颗粒；化学处理：转型（氢型或钠型）阳离子树脂 酸—碱—酸，阴离子树脂 碱—酸—碱，最后以去离子水或缓冲液平衡 32.何谓等电点沉析法？
答:蛋白质再等电点下的溶解度最低，根据这一性质，再溶液中加入一定比例的有机溶剂，破坏蛋白质表
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面的水化层和双电层，降低分子间斥力，加强了蛋白质分子间的疏水相互作用，使得蛋白质分子得以聚集成团沉淀下来。
33.简述凝胶色谱的分离原理？
答：凝胶排阻色谱的分离介质（填料）具有均匀的网格结构，其分离原理是具有不同分子量的溶质分子，在流经柱床是，由于大分子难以进入凝胶内部，而从凝胶颗粒之间流出，保留时间短；而小分子溶质可以进入凝胶内部，由于凝胶多孔结构的阻滞作用，流经体积变大，保留时间延长。这样，分子量不同的溶质分子得以分离。
34.何谓免疫亲和层析，简述亲和免疫层析介质的制备过程?
答、免疫亲和层析是利用亲和技术和色谱分离集成产生的一种高效色谱分离技术，其分离原理是通过抗原-抗体之间特异性的相互作用，从而实现高效的分离。层析介质的制备过程包括：抗体的制备、抗体提取、载体活化，手臂链的连接、抗体的连接等步骤。 35.何谓亲和吸附，有何特点？
答：亲和吸附是吸附单元操作的一种，它是利用亲和吸附剂与目标物之间的特殊的化学作用实现的高效分离手段。亲和吸附剂的组成包括：惰性载体、手臂链、特异性亲和配基。亲和吸附的特点是高效、简便、适用范围广、分离速度快、条件温和，但载体制备难度大，通用性差，成本较高。 36.简述有机溶剂沉析的原理？
答：1、概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。 2、原理：（1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。（2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。
37. 盐析的原理及影响因素？
1、亲水性大于蛋白质破坏水化层2、带电离子中和蛋白质表面电荷 影响因素：（1）盐离子浓度（2）生物分子种类（3）生物分子浓度（4） pH值（五）温度 38. 影响有机溶剂沉析的因素？
（1）温度（2）生物样品的浓度（3）pH（4）离子强度（5）金属离子
39. 等电点沉析注意事项？（1）等电点的改变（2）目的物的稳定性（3） 盐溶作用（4）pH的调节 40. 交换容量及其影响因素？
交换容量是指离子交换剂能提供交换离子的量，它反映离子交换剂与溶液中离子进行交换的能力。通常所说的离子交换剂的交换容量是指离子交换剂所能提供交换离子的总量，又称为总交换容量，它只和离子交换剂本身的性质有关。影响交换容量的因素很多，主要可以分为两个方面，一方面是离子交换剂颗粒大小、颗粒内孔隙大小以及所分离的样品组分的大小等影响。另一些影响因素如实验中的离子强度、pH值等主要影响样品中组分和离子交换剂的带电性质。 41. 疏水柱层析分离原理？
亲水性蛋白质（酶）表面均含有一定量的疏水性基团。尽管在水溶液中蛋白质（酶）具有将疏水性基团折叠在分子内部而表面显露极性和荷电基团的趋势，但总会有一些疏水性基团或极性基团的疏水部位暴露在蛋白质（酶）表面。这部分疏水基团可与亲水性固定相表面偶联的短链烷基、苯基等弱疏水基会发生疏水性相互作用，被固定相（疏水性吸附剂）所吸附。 42. 气相色谱的条件选择？
1、固定相的选择2、载气流速的选择3、柱温的选择4、进样量与进样时间的影响5、色谱柱形、柱内径及柱长的选择
43. 影响电泳分离的主要因素？
1、大分子的性质2、电场强度3、溶液的pH 4、溶液的离子强度5、 电渗6、温度7、支持物的影响 44. 试列举常见的吸附剂。 （1）活性炭（2）白陶土（白土、陶土、高岭土）（3）磷酸钙凝胶（4）氢氧化铝凝胶（5）氧化铝（6）
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硅胶（7）滑石粉（8）硅藻土（9）皂土（10）沸石（11）聚酰胺粉（12）大网格聚合物吸附剂
45. 吸附色谱分离化学成分的原理是什么？简述硅胶、氧化铝、聚酰胺、活性炭这四种吸附剂的主要用途和特点？
利用混合物中各成分在两相中吸附力的差异进行分离。硅胶可分离各类成分。氧化铝分离碱性或亲脂性成分。活性炭分离水溶性成分。聚酰胺是氢键吸附，适合分离黄酮成分。 46. 试列举改变透析袋孔径大小的方法？
（1）用64%氯化锌溶液处理15分钟，可使膜孔径增大，使大分子也能通过膜孔。（2）纤维素膜用27%乙酸吡啶溶液处理，会使孔径减小。（3）将透析袋内盛满水，在两端进行拉伸，会使透析袋变薄，加快透析速率；如果不向袋内注入水而充满空气在两端拉伸，膜的孔径会变小，使有些溶质不能透过膜。 47. 简述生物活性物质分离纯化的主要原理？
答： 生物大分子分离纯化的主要原理是：1）根据分子形状和大小不同进行分离，如差速离心与超离心、膜分离、凝胶过滤等；2）根据分子电离性质（带电性）差异进行分离，如离子交换法、电泳法、等电聚焦法；3）根据分子极性大小及溶解度不同进行分离，如溶剂提取法、逆流分配法、分配层析法、盐析法、等电点沉淀及有机溶剂分级沉淀等；4）根据物质吸附性质的不同进行分离，如选择性吸附与吸附层析等；5）根据配体特异性进行分离，如亲和层析法等。 48. 树脂的再生（或称活化）？
所谓树脂的再生就是让使用过的树脂重新获得使用性能的处理过程，树脂的再生反应是交换吸附的逆反应。再生方法可根据污染情况和条件而定，一般阳树脂在软化中易受Fe3+污染，清除铁化合物的方法，通常是用加抑制剂的高浓度盐酸（10%～15%）浸泡树脂5～12h，甚至更长。也可用柠檬酸、氨基三乙酸、EDTA等络合物进行处理。阴树脂易受有机物污染，可用10%NaCl+2%～5%NaOH混合溶液浸泡或淋洗 49. 简述凝胶层析有哪些用途？
①作为分析工具；作为脱盐工具②生物大分子的浓缩③除热原物质④生物大分子的分离纯化；分子量的测定
50. 蛋白质的纯度鉴定的方法有哪些。
(1)色谱法用分子筛或离子交换色谱检查样品时，如果样品是纯的，应显不单一的洗脱峰。该样品在色谱性质上是均一的，称为“色谱纯”。(2)电泳法用PAGE检查样品呈现单一区带，也是纯度的一个指标，这表明样品在电荷和质量方面的均一性。可以说纯的蛋白质电泳仅有一条区带，但仅有一条区带却不一定是纯的，仅能表明它在电泳上的均一性，称为“电泳纯”。(3)免疫化学法 免疫学技术是鉴定蛋白质纯度的有效方法，它根据抗原与抗体反应的特异性，可用已知抗体检查抗原或已知抗原检查抗体。用此法检测的纯度称为“免疫纯”。
51. 根据溶解度不同，蛋白质有几种分离纯化方法。
利用蛋白质溶解度的差异是分离蛋白质的常用方法之一。影响蛋白质溶解度的主要因素有溶液的pH值、离子强度、溶剂的介电常数和温度等。 1)等电点沉淀蛋白质在等电点时溶解度最小。单纯使用此法不易使蛋白质沉淀完全，常与其他方法配合使用。2)盐析沉淀 中性盐对蛋白质胶体的稳定性有显著的影响。一定浓度的中性盐可破坏蛋白质胶体的稳定因素而使蛋白质盐析沉淀。盐析沉淀的蛋白质一般保持着天然构象而不变性。有时不同的盐浓度可有效地使蛋白质分级沉淀。通常单价离子的中性盐(NaCl)比二价离子的中性盐[(NH4)2SO4]对蛋白质溶解度的影响要小。3)低温有机溶剂沉淀法在一定量的有机溶剂中，蛋白质分子间极性基团的静电引力增加，而水化作用降低，促使蛋白质聚集沉淀。此法沉淀蛋白质的选择性较高，且不需脱盐，但温度高时可引起蛋白质变性，故应注意低温条件。一般在0～40℃之间，多数球状蛋白的溶解度随温度的升高而增加；40～50℃以上，多数蛋白质不稳定，并开始变性。因此对蛋白质的沉淀一般要求低温条件。
52．进行细胞破碎的方法有哪些：①机械破碎法：是通过机械运动所产生的剪切力的作用使细胞破碎的方法。②物理破碎法：用各种物理因素(温度、压力、超声波)的作用使细胞破碎的方法。③化学破碎法：用化学试剂可使细胞膜结构改变或破坏，改变细胞膜的通透性。④酶学破碎法：通过加入酶或利用细胞本身
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的酶的作用，使细胞破碎的方法。
53．蛋白质和酶提取、分离的一般原则：①提取、分离方法条件要温和使目的蛋白质和酶的活性和功能不受损害②尽量尽早除去各种杂质、脂类、核酸及毒素。③设法除去变性的和不需要的蛋白质。④设法提高目的蛋白质的含量或生物活性。⑤分离纯化要在缓冲溶液中进行。⑥建立灵敏、特异、精确的检测方法。⑦根据其存在的部位、分子结构及溶解性质的不同选择不同的提取方法。
54．实验室进行蛋白质盐析沉淀时应用最多、最广的是硫酸铵，它的优缺点是什么：优点：①它在水中溶解度大；②其溶解度受温度的影响较小；③价廉易得；④不易引起蛋白质变性；⑤分离效果比其它盐好。缺点：①缓冲能力差；②NH4+离子会干扰蛋白氮的测定。
55．核酸提取要注意的原则：①防止核酸酶的降解: 在提取分离核酸时要降低核酸酶的活性，通常加入抑制剂和去激活剂。②防止化学因素的降解: 避免强酸强碱。③防止物理因素的降解: 核酸大分子、高温、机械作用等均可以破坏核酸分子的完整性，因此核酸提取适于在低温及避免剧烈搅拌等条件下进行。 56. 选择吸附剂时应注意的问题：
①吸附剂应有适当的吸附力和尽量大的表面积；②对被分离物有足够的分辨率，对不同物质的吸附力不同；③对被吸附物的吸附应是可逆的，一定条件下可解吸、洗脱；④不溶于所用的溶剂中，不引起被吸附物化学变化；⑤颗粒均匀，操作时稳定，不会破裂。 57. 选择洗脱剂时应注意的问题：
①不与吸附剂起化学反应，且不使吸附剂溶解；②对样品的各组分溶解度大、粘度小、流动性好；③不与各组分起化学反应，且易与被洗脱组分分开；④纯度高，无杂质影响。
58. 纸层析时对滤纸的选择有何要求：滤纸的厚薄程度、纤维的松紧度不同，使与滤纸纤维结合的水量不一样，两相的体积比也不同。得到的Rf 值也不相同。滤纸中的杂质也会影响Rf 值。因此，层析时对滤纸的要求较高：由高纯度的棉花制成，质地均一、厚薄一致、纤维松紧度适中、有一定的机械强度。 59. 在纸层析前，滤纸和层析装置为什么要先用层析溶剂平衡：层析前滤纸与层析装置用溶剂系统的蒸气饱和。不平衡时滤纸会从溶剂中吸收水分，溶剂也会从滤纸表面挥发，使溶剂系统的组成发生改变，导致溶剂前沿不齐，影响层析效果和Rｆ值。
60. 担体应具备哪些条件：①表面积大；②孔径分布较均匀；③表面无催化或吸附性能；④与固定液或被分析的物质不起化学反应；⑤热稳定性好；⑥有较好的机械强度。
61. 离子交换剂选择时应考虑哪些因素：①样品离子带何种电荷 阴离子只能被阴离子交换剂吸附，阳离子只能被阳离子交换剂吸附；②离子的浓度 浓度大时，选择交换容量大的交换剂型号③被分离物质相对分子量的大小 分子量大时要求交联度低，分子量小时选择较高交联度更好；④离子与交换剂亲和力的大小 选择不同型号的交换剂，既要考虑吸附，还要考虑便于洗脱；⑤样品物质及交换树脂的物理化学特性 根据其对酸、碱、温度的敏感情况，控制好环境条件。 62. 试述聚丙烯酰胺凝胶具有哪些的优点：（１）在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g；(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度,通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高,尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。
63. 等电聚集电泳具有哪些优缺点：优点： ⑴分辨率高；⑵随电泳时间增加区带越来越窄；⑶样品加在任何部位都可以聚焦到等电点pH位置；⑷很稀的样品都可分离，且重现性好；⑸可用于测定多肽或蛋白质的等电点。缺点：①要求使用无盐溶液，但某些蛋白质在无盐溶液中溶解度低，易产生沉淀。②对一些在pI不溶解或发生变性的蛋白质不适用。
64. 对载体两性电解质有什么要求：①在pI处必须有足够的缓冲能力，以便控制pH梯度。②在pI处必须有足够的电导，以便使一定电流通过。而且，各不同pI值的载体有相同的电导系数，使整个体系中电导均匀，获得均匀的电场。③相对分子质量要小，以便在聚焦后能容易地和蛋白质组分分开。④化学组
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