分不同于被分离物质，以免干扰测定。⑤不与被分离物质起化学反应，也不会引起被分离物质变化。 65. 在生化领域中，应用荧光检测的方法在哪些：在生化领域中，应用荧光检测的方法分三类：①直接用荧光性物质检测②利用非荧光性物质与荧光试剂反应，生成荧光性物质③在荧光性物质溶液中加入消光物质。
四、问答题
1.一种植物叶中得到了粗细胞提取液，每毫升含蛋白质32mg，在提取条件下，10μl提取液的催化反应速度为0.14μmol/min,取50μl提取液用硫酸铵盐析分离，将饱和度0.3-0.6的沉淀再溶于10ml水中，此溶液的蛋白浓度为50mg/ml，从中取出10μl，测定其反应速度为0.65μmol/min,计算:
a) 提取过程中酶的回收百分率
b) 酶的提纯倍数 c) 2、离子交换层析的洗脱方式可分为哪几种？ 答：三种。
（1）简单洗脱：柱子始终用同样的一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大，其区带的洗脱时间间隔（或洗脱体积间隔）也不长，采用这种方法是适宜的。但选择的溶剂必须很合适方能使各组分的分配系数差异较大。
（2）分步洗脱：按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液，进行逐级洗脱。它主要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。
（3）梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、离子强度、极性或pH值等。最常用的是浓度梯度。在水溶液中 ，亦即离子强度梯度。 2.聚焦层析原理
聚焦层析原理可以从pH梯度溶液的形成、蛋白质的行为和聚焦效应三方面来阐述。 （1） pH梯度溶液的形成
在聚焦层析中，当洗脱液流进多缓冲交换剂时，由于交换剂带具有缓冲能力的电荷基团，故PH梯度自动形成。先用起始缓冲液平衡到pH9,再用含pH6的多缓冲剂物质的淋洗液通过柱体，这时多缓冲剂中酸性最强的组分与碱性阴离子交换剂结合发生中和作用。随着淋洗液的不断加人，柱内每点的pH值从高到低逐渐下降。照此处理一段时间，从层析柱顶部到底部就形成了pH6一9的梯度。聚焦层析柱中的但是随着淋洗的进行梯度择臼夜是在淋洗过程中自动形成的恒定于此值，这时层析的梯度也就消失了。
（2）蛋白质的行为蛋白质所带电荷取决于它的等电点和层析柱的PH值。洗脱剂向前移动，固定相中的PH值随时间的变化而变化。当蛋白质移动至环境PH值高与PI值时，蛋白质带负电荷，与阴离子交换剂结合。蛋白质周围环境PH值低于PI值时带正电荷，被解吸下来。从而蛋白质按等电点大小被洗下来。 （3）聚焦效应
蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。pH梯度的形成是聚焦效应的先决条件。蛋白质加到已形成PH提督的层析柱时，由于洗脱液的连续流动，他迅速的移动到与等电点相同的PH值处。从此位置开始，蛋白质将缓慢的速度进行吸附，解吸附，直到PH, 答：提高分辨率的选择包括：选择包括各个待分离组分但分离范围尽量小一些的凝胶，选择颗粒小的凝胶，选择分辨率高的凝胶类型，选择较长的层析柱，减少加样量，降低洗脱速度等。各种选择都有一个限度的问题，超过这个限度可能会产生相反的效果。 4.简述等电聚焦法的基本原理？ 答：这种按等电点的大小，生物分子在pH梯度的某一相应位置上进行聚焦的行为称为等电聚焦（Isoelectric focusing）。等电聚焦电泳是根据两性物质等电点（pI）的不同而进行分离的，它具有很高的分辨率，可以分辨出等电点相差pH 0.01的蛋白质，是分离两性物质如蛋白质的一种理想方法。等电 16 聚焦电泳也可称为非连续pH电泳，它利用人工合成的两性电解质（脂肪族多胺基多羧基的混合物，商品名ampho1in）在通电后形成一定的pH梯度，两性物质在电泳过程中会被集中在与其等电点相等的pH区域内，从而得到分离。样品中蛋白质所带的电荷取决于放置样品处凝胶的pH值，等电点在pH值以上的蛋白质带正电，在电场的作用下向阴极移动，在迁移过程中，蛋白质所处的凝胶的pH值逐渐升高，蛋白质所带的正电逐渐减少，到达pH＝pI处的凝胶区域时蛋白质不带电荷，停止迁移。同样，等电点在上样处凝胶pH以下的蛋白质带负电，向阳极移动，最终到达pH＝pI处的凝胶区域停止。可见等电聚焦过程无论样品加在凝胶上什么位置，各种蛋白质都能向着其等电点处移动，并最终到达其等电点处。不同的两性电解质有不同的pH梯度范围，既有较宽的范围如pH＝3～10，也有各种较窄的范围如pH＝7～8。要根据待分离样品的情况选择适当的两性电解质，使待分离样品中各个组分都在两性电解质的pH范围内，两性电解质的pH范围越小，分辨率越高。 5.生物大分子制备中最常用的沉淀方法有哪几种？ 答：生物大分子制备中常用的几种沉淀方法是：⑴ 中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。⑵ 有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。⑶ 选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。⑷ 等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。⑸ 有机聚合物沉淀：是发展较快的一种新方法，主要使用聚乙二醇（PEG Polyethyene glycol）作为沉淀剂。 6.不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应是如何产生的？ － 答：这是由于在电泳缓冲液中主要存在三种阴离子，Cl、甘氨酸阴离子以及蛋白质。 － 在浓缩胶的pH值下，甘氨酸只有少量的电离，所以其电泳迁移率最小，而Cl的电泳迁移率最大，在浓缩 －－ 胶中Cl是快离子（前导离子），甘氨酸是慢离子（尾随离子）。在电场的作用下，Cl最初的迁移速度最快， －－ 这样在Cl后面形成低离子浓度区域，即低电导区，而低电导区会产生较高的电场强度，因此Cl后面的 － 离子在较高的电场强度作用下会加速移动。达到稳定状态后，Cl和甘氨酸之间形成稳定移动的界面。（3 － 分）而蛋白质由于相对量较少，聚集在甘氨酸和Cl的界面附近而被浓缩成很窄的区带（可以被浓缩三百倍）。 附资料： 1）凝胶孔径不连续性：在3 层凝胶中样品胶及浓缩胶为大孔径胶，在2 层凝胶中样品/浓缩胶为大孔径胶，分离胶为小孔径胶；在电场作用下，被分离物在大孔径中移动遇到阻力小，移动速度快，当进入小孔径胶时，被分离物移动受到阻力大，移动速度变慢，因而在两种胶的交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。 2）缓冲体系离子成分及pH 值的不连续性：在浓缩胶中，由于被分离物的pI 介与前导离子与尾随离子的pK 之间，共同向正极移动，并被浓缩成极窄的区带里。 3）电位梯度的不连续性：在不连续系统中，电位梯度的差异是自动形成的。电泳开始后，由于前导离子的迁移率最大，就会很快超过被分离物，因此在快离子后面，形成一个离子浓度低的区域，这时就有了较高的电位梯度。这种高电位梯度使后面被分离物和尾随离子在前导离子后面加快移动。当前导离子、被分离物和尾随离子的移动速度相同时，建立一种稳定状态，这时在前导离子和尾随离子之间形成一个稳定而又不断向正极移动的界面，这就是样品被浓缩的中间层。不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳包含了两种以上的缓冲液成分,pH 值和凝胶孔径,而且在电泳过程中形成的电位梯度亦不均匀，由此产生浓缩效应。 7.影响电泳时泳动度的主要因素有哪些？ （1）、首先决定于带颗粒的性质，即颗粒所带净电荷的数量，大小及形状。一般说来，颗粒带净电荷多，直径小而接近于球形，则在电场中泳动速度快，反 之则慢。 （2）、电场强度。一般电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。 （3）、溶液的pH值。溶液的pH值决定了带电颗粒解离的程度，也决定了物质所带净电荷的多少，对于蛋白质，氨基酸等两性电解质而言，溶液pH值离电点越远，颗粒所带净电荷越多；电 泳速度越快；反之则越慢。 17 （4）、溶液的离子强度。溶液的离子强度越高，带电颗粒泳动速度越慢，反之越快。 （5）、电渗作用。电渗是指在电场中液体对固体支持物的相对移动。在电场中，若带负电荷颗粒向正极移动，而介质却向阴极移动，从而对颗粒的泳动起阻碍作用；反之加快。 8.简述聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理。 答：凝胶聚合原理： 聚丙烯酰胺凝胶由Acr和Bis聚合而成。Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但存在游离基时，它们就聚合成凝胶。引发产生游离基的方法有化学法和光学法两种。 （1）化学聚合 即过硫酸铵（AP）－四甲基乙二胺（TEMED）系统。AP是提供自由基的引发剂，TEMED是加快引发自由基的加速剂。 2－2－ 过硫酸铵能形成自由基：S2O8—→2SO4 2－ SO4与Acr接触发生反应，使Acr的键打开，形成自由基。这种活化了的Acr分子再以同样的方式连续地与其它Acr反应，结果就形成了一个长链聚合物。这种长链聚合物溶液还需要进行交联，交联剂是N,N—甲叉双丙烯酰胺（CH2＝CH－CO－NH－CH2－NH－CO－CH＝CH2），可以看作是两个丙烯酰胺分子通过亚甲基将它们的无活性末端偶联在—起形成的化合物，这样聚合后就得到网状聚丙烯酰胺链。 （2）光聚合 光聚合以光敏物质核黄素代替AP作催化剂。 核黄素经强光照射后引发自由基，后者使Acr形成自由基并聚合成凝胶。TEMED并非必需，但加入可加速聚合。 光聚合要有衡量的氧存在，但过量的氧能淬灭自由基，阻止链长的增加，故聚合反应时要抽气以减少氧含量。聚合反应的温度以20～25℃为宜。 9.试述凝胶过滤法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量的原理？ 答：（1）凝胶过滤法。凝胶过滤法分离蛋白质的原理是根据蛋白质分子量的大小。由于不同排阻范围的葡聚糖凝胶有一特定的蛋白质分子量范围，在此范围内，分子量的对数和洗脱体积之间成线性关系。因此，用几种已知分子量的蛋白质为标准，进行凝胶层析，以每种蛋白质的洗脱体积对它们的分子量的对数作图，绘制出标准洗脱曲线。未知蛋白质在同样的条件下进行凝胶层析，根据其所用的洗脱体积，从标准洗脱曲线上可求出此未知蛋白质对应的分子量。 （2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法。蛋白质在普通聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度取决于蛋白质分子的大小、分子形状和所带电荷的多少。SDS（十二烷基磺酸钠）是一种去污剂，可使蛋白质变性并解离成亚基。当蛋白质样品中加入SDS后，SDS与蛋白质分子结合，使蛋白质分子带上大量的强负电荷，并且使蛋白质分子的形状都变成短棒状，从而消除了蛋白质分子之间原有的带电荷量和分子形状的差异。这样电泳的速度只取决于蛋白质分子量的大小，蛋白质分子在电泳中的相对迁移率和分子质量的对数成直线关系。以标准蛋白质分子质量的对数和其相对迁移率作图，得到标准曲线，根据所测样品的相对迁移率，从标准曲线上便可查出其分子质量。 10.简述柱层析的基本操作？ 答：⑴ 装柱：选柱要根据层析的基质和分离目的而定。柱子装得要均匀，不分层，柱子无气泡，表面平整。注意不能干柱、分层，否则必须重装。⑵ 平衡：柱子装好后，要用所需的缓冲液平衡柱子。平衡液体积一般为3～5倍柱床体积。⑶ 加样：加样量的多少直接影响分离的效果。一般讲，加样量尽量少些，分离效果比较好。通常加样量应少于20%的操作容量，体积应低于5%的床体积，对于分析性柱层析，一般不超过床体积的1%。⑷ 洗脱：洗脱的方式可分为三种，简单洗脱、分步洗脱、梯度洗脱。⑸ 收集、鉴定及保存：每管的收集量不能太多，一般1mL～5mL/ 管。合并一个峰的各管溶液之前，要进行鉴定。一般采用透析除盐、超滤或减压薄膜浓缩，再冰冻干燥，得到干粉，低温保存备用。⑹ 基质的再生：许多基质（吸附剂、交换树脂或凝胶等）价格昂贵，可以反复多次使用，层析后要回收处理，以备再用，严禁乱倒乱扔。 18 11.试述亲和层析的洗脱方法有哪些？ 答：亲和层析的洗脱方法可以分为两种：特异性洗脱和非特异性洗脱。 ⑴ 特异性洗脱 特异性洗脱是指利用洗脱液中的物质与待分离物质或与配体的亲和特性而将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱下来。 特异性洗脱分两种： 一种是选择与配体有亲和力的物质进行洗脱，选择一种和配体亲和力较强的物质加入洗脱液，这种物质与待分离物质竞争对配体的结合，与配体结合的待分离物质被取代而脱离配体，从而被洗脱下来。如用凝集素作为配体分离糖蛋白时，可以用适当的单糖洗脱，单糖与糖蛋白竞争对凝集素的结合，可将糖蛋白从凝集素上置换下来。 另一种是选择与待分离物质有亲和力的物质进行洗脱。这种物质与待分离物质的亲和力强或浓度较大，待分离物质就会被这种物质结合而脱离配体，从而被洗脱下来。如用染料作为配体分离脱氢酶时，可 ＋＋＋ 选择NAD进行洗脱，NAD是脱氢酶的辅酶，它与脱氢酶的亲和力要强于染料，所以脱氢酶就会与NAD结合而从配体上脱离。 ⑵ 非特异性洗脱 非特异性洗脱是指通过改变洗脱缓冲液pH、离子强度、温度等条件，降低待分离物质与配体的亲和力而将待分离物质洗脱下来。 12. 一种分子量为24,000、pI为5.5的酶被一种分子量类似、但pI为7.0的蛋白质和另外一种分子量为100,000、pI为5.4的蛋白质污染。提出一种层析法纯化该酶的方案。 答：用凝胶过滤(即分子排阻层析)法先除去分子量为100,000、pI为5.4的蛋白质，余留下来的低分子量的含酶的混合物再用离子交换层析法分离，于是就能获得所需要的纯酶。 13.SDS-PAGE结果不满意或失败的原因有哪些？ （1）SDS与蛋白质的结合按质量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白质），蛋白质含量不可以超标，否则SDS结合量不足。 （2）用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时作标准曲线。不能利用这次的标准曲线作为下次用。并且SDS-PAGE测定分子量有10％误差，不可完全信任。 （3）有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量。 （4）有的蛋白质（如：电荷异常或结构异常的蛋白质；带有较大辅基的蛋白质）不能采用该法测相对分子量。 （5）如果该电泳中出现拖尾、染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯引起。 14. 按层析过程的机理，层析法分哪几种？按操作形式不同又分哪几类？ 根据分离的原理不同分类，层析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、疏水层析和聚焦层析等。按操作形式不同又可以分为纸层析、薄层层析和柱层析等。 15. 在含A、B、C、D四种蛋白质组分的混合液中，A和B均为含有葡萄糖链的糖蛋白，其等电点分别为5.0和5.5，而C和D的相对分子质量分别为40 000和50 000，试设计用层析法分离它们的方案。 答：亲和层析，用凝集素做配体，将A、B两种糖蛋白从混合物中分离出来，再用聚焦层析将A、B分离开，而C、D可以采用凝胶过滤层析分离开。 16.试述凝胶过滤柱层析的一般操作步骤？ 答：（1）凝胶的选择。根据层析物质分子量的大小选择不同型号的凝胶。 （2）凝胶的预处理。称取适量的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱（或室温）中充分膨胀，或在沸水中煮，膨胀时间应根据不同型号的凝胶而定。 19 （3）装柱。层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。去盐约为样品体积的4～10倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。 （4）加样。样品体积不宜过多，最好为床体积的1％～5%，最多不要超过10%。样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%。（1分） （5）洗脱。洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH值。 （6）洗脱液收集。 （7）凝胶柱的重复使用与保存。 17.、阐述聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应？ 聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应： (1)浓缩效应—样品胶和浓缩胶选用pH6.7 Tris/HCI缓冲液，电极液选用pH8.3 Tris/甘氨酸缓冲液时，盐酸解离全部氯离子，甘氨酸（pK'a为2.34,pK\为9.7）则只有l％-0.1%解离释放出甘氨酸根离子 -一 (NH2-CH2-C00)，而酸性蛋白质一般在浓缩胶中解离后为带负电荷的离子。泳动率最大的Cl称为快离子 一 （又称前导离子）；把最小的NH2- CH2 COO称为慢离子。在电泳刚开始时，三层凝胶（样品胶、浓缩胶和分离胶）中都含有快离子，只是电极缓冲液中含有慢离子。电泳进行时，由于快离子的泳动率最大，因此很快超过蛋白质，于是在快离子后边形成一离子浓度低的区域， 在高电场强度区和低电场强度区之间形成一个迅速移动的界面。由于样品蛋白质的有效泳动率恰好介于快、慢离子之间，因而它就聚集在这个移动界面的附近，并浓缩为一个狭窄的中间层（浓缩300多倍）。 (2)电荷效应—蛋白质混合物在界面处被高度浓缩、堆积成层，并形成一狭窄 的高浓度蛋白质区。但由于每种蛋白质分子所载的有效电荷不同，故泳动率亦不 同。所以各种蛋白质样品经分离胶电泳后，若样品组分的分子质量相等，则它们就 以圆盘状或带状按电荷顺序一个一个地排列起来。 (3)分子筛效应—当夹在快离子和慢离子中间的蛋白质由浓缩胶进人分离胶 时，分离胶的pH值和凝胶孔径与浓缩胶是不一样的。分离胶选用Tris/ HCl缓冲液 配制，其pH8.9(电泳时实际测量是9.5),与甘氨酸的pKa值(9.7-9.8)相近。这就致使慢离子的解离度增大，因而其有效泳动率也相应增大。此时慢离子的有效泳动率超过了所有的蛋白质分子，从而慢离子逐渐赶上并超过所有的蛋白质分子，随之高电场强度消失。于是，蛋白质样品就在均一的电场强度和pH条件下通过一定孔径的分离胶。当蛋白质的分子质量或构型不同时，通过分离胶所受到的摩擦力和阻滞程度就不同，最终表现出的泳动率也不同，这就是所说的分子筛效应。 18. 影响离子交换树脂交换速度的因素？ ①树脂颗粒的大小：树脂颗粒大小要适中。②搅拌和流速。 ③离子浓度：过稀、过浓都对交换速度不利。④离子的水化半径：离子在水溶液中要发生水化，水化离子在水溶液中的大小以水化 半径来表示。水化半径小的离子，较易吸附。一价阳离子；Li+ 阴离子：F ⑥交联度愈低，树脂愈易膨胀，交换速度也就愈快。 ⑦有机溶剂的影响：当有机溶剂存在时，会降低树脂对有机离子的选择性，而容易吸附无机离子。 19.凝胶过滤层析中完全排阻，完全渗透分子Kd值的理论区间？完全渗透分子Kd 高于其理论值的可能原因有哪些？ 答：1）完全排阻分子的Kd 值为0，完全渗透分子的Kd值为1，不完全渗透分子的Kd值理论区间为0 20 身并不带电荷，但在保存和使用的过程中可能因为氧化等原因产生羧基等而带上负电荷，，此时带正电荷的物质因静电力导致Kd 值升高。 附资料：首先将样品加入，接着以水或其他溶液进行洗脱，即得洗脱曲线。最先流出的是物质A，A 的分子量最大，完全不能进入颗粒内部，只能从颗粒间隙流过，称“全排阻”。其流经体积最小，等于外水体积V 0 。最后流出的是物质C，它的分子量最小，其分子可以自由进出凝胶颗粒，这叫做“全渗入”。流经体积是外水体积与内水体积之和V 0 +V i 。物质B 的分子量介于渗入限与排阻限之间，其分子能够部分地进入凝胶颗粒之中。这叫作“部分排阻”或“部分渗入”。它的流径体积V e 是全部外水体积加上内水体积的一部分，即V e =V0 +K d V i 。K d 称作“排阻系数” 或“分配系数”。分配系数K d 排阻系数： 当K d =1 时，洗脱体积V e =V 0 +V i ，为全渗入。当K d =0 时，洗脱体积V e =V 0 ，为全排阻。0＜K d ＜1 时，洗脱体积V e =V o +K d V i ，为部分渗入。在特殊情况下，某些物质的Kd 值可以大于1，这是因为该种物质分子与凝胶之间有吸附作用。小分子物质的K d 值却小于1，这是因为有水合作用的存在。其中包括该物质分子的水合作用，或者是凝胶本身的水合作用。 20.离子交换层析装柱时，树脂在柱内有明显的分界线，这是由于什么原因造成的？ 答：装柱 转型再生好的交换剂先放人烧杯，加入少量水，边搅拌边倒人垂直固定的层析柱中，使交换剂缓慢沉降。交换剂在柱内必须分布均匀，不应有明显的分界线，严防气泡产生，否则将严重影响交换性能。为防止气泡和分界线(即所谓“节”)的出现，在装柱时，可在柱内先加入一定高度的水，一般为柱长的1／3，再加人交换剂就可借水的浮力而缓慢沉降。同时控制排液口放速率，以保持交换剂面上水的高度不变，交换剂就会连续地缓慢沉降，“节”和气泡就不会产生。 21