四川农业大学
动物微生物学及免疫学教学实践实验报告
大肠杆菌与沙门氏菌混合感染的猪病料病原菌的
分离与鉴定
专 业： 动物医学
班 级: 组 别 ： 第 一 组 指 导 教 师：
二○一○年六月
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目录索引
一 培养基的制备............................................................4 二 病料接种、培养及细菌抹片的制备和G染色...................................5 三 细菌的纯培养、移植和细菌抹片的制备及G染色...............................6 四 TSI培养基培养及生化鉴定................................................7 五 实验结果...............................................................10 六 讨论及结论.............................................................11
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一 培养基的制备
﹝目的要求﹞
掌握一般培养基的制备原则和要求；熟悉一般培养基的制备过程；掌握培养基酸碱度的测定。 ﹝实验材料﹞
（1）器皿：量筒（100ml两个）、烧杯（100ml和1000ml各一个）、漏斗（两个）、三角烧瓶（100ml两个）、试管（七支）、玻璃棒（两根）、玻璃平皿、刻度吸管（1ml和10ml各两个）、PH试纸、纱布、脱脂棉、天平、电炉、试管塞、扎绳、包装纸、洗耳球、酒精灯。
（2）试剂：牛肉膏，蛋白胨，氯化钠，磷酸氢二钾，琼脂条或粉，0.1mol/L和1mol/L的氢氧化钠、0.1mol/L的盐酸溶液、蒸馏水、麦康凯琼脂粉、三塘铁琼脂粉。
﹝方法内容﹞
（1）按下表计量称取各种试剂（先称取盐类再称取蛋白胨及牛肉膏），置于铝锅或搪瓷缸中。 牛肉膏 1.0g
（2）普通琼脂：原料称量（按配方）—→溶解—→调节PH—→塞棉塞和包扎—→灭菌 麦康凯琼脂：原料称量（按配方）—→溶解—→装入盐水瓶—→塞棉塞和包扎—→灭菌 三塘铁琼脂：原料称量（按配方）—→溶解—→分装入试管—→塞棉塞和包扎—→灭菌 （3）培养基的分装：用玻璃漏斗、橡皮管、小玻璃管及弹簧夹制作分装装置—→选用15×150平口试管或300ml锥形瓶—→分装（每管约10ml）
（4）棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎 分别制作试管和锥形瓶的棉塞并塞好，再用干洁的报纸将其头部包扎好。
（5）培养基的灭菌 将培养基置于高压蒸汽锅内，121℃灭菌15至30min。
（6）TSI斜面、普琼和麦康凯琼脂平板的制作 TSI斜面：灭菌后趁热将管口一端搁在玻棒上，使之有一定坡度，凝固后即形成斜面。普琼和麦康凯琼脂平板的制作：普通琼脂和麦康凯琼脂以手掌感触，若将琼脂瓶紧握手中觉得烫手，但仍能握持时，即为倾倒平皿的合适温度。每只灭菌培养皿倒10到15ml将皿盖盖上，将培养皿与桌面上轻轻回转，使培养基平铺于皿底，即形成普通琼脂平板和
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蛋白胨 2.0g 氯化钠 1.0g 琼脂粉 4.0g 蒸馏水 200ml
麦康凯琼脂平板。
﹝结果分析﹞ 以斜面接种培养验证培养基配置效果；以平板制作及接种24h培养验证24h；
二 病料接种、培养及细菌抹片的制备和G染色
﹝目的要求﹞掌握细菌分离培养的基本要领和方法；掌握厌氧菌培养的原理及方法；掌握细菌抹片的制备方法和G染色法；认识革兰氏染色的反应特性。
﹝实验材料﹞载玻片、火柴、吸水纸、生理盐水、各种染色液、菌种（病料）、剪刀、记号笔、普通琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、接种环、酒精灯。 ﹝方法内容﹞
1、器械、病料消毒（剪刀、接种环、病料）—→勾取病料—→划线接种 —→培养。
（1）左手持皿，用左手的拇指、食指及中指将皿盖揭开呈20°左右的角度（角度越小越好，避免空气污染）。
（2）右手持接种环，分别从已表面消毒的病猪肺、肝、肾中挑取病料涂布于培养基边缘，然后将接种环上多余的材料在火焰中烧毁，带接种环冷却后，再与所涂材料的地方轻轻接触，开始划线。 （3）划线前先将接种环稍稍弯曲，这样易和平皿内琼脂面平行，不至划破培养基。 （4）划线中不宜过多的重复旧线，以免形成菌苔。
（5）接种完毕，在皿底上作好菌名、日期和接种者等标记，平皿倒扣，置于37℃培养24h。 注：划线接种于6个普通琼脂平板和6个麦康凯琼脂平板。
2、G染色：涂片—→干燥—→火焰固定—→染色—→水洗—→干燥—→油镜观察 （1）在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸结晶紫溶液，经1~~2min水洗。 （2）加革兰氏碘液于抹片上媒染，作用1—2min，水洗。 （3）加95%的酒精与抹片上脱色，约0.5—1min，水洗。
（4）加稀释的石碳酸复红（或沙黄水溶液）复染10—30s，水洗。
（5）吸干或自然干燥，镜检。革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
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三 细菌的纯培养、移植和细菌抹片的制备及G染色
﹝目的要求﹞掌握细菌纯培养的基本要领和方法；掌握兼性厌氧菌培养的原理及方法；掌握细菌抹片的制备方法和G染色法；认识革兰氏染色的反应特性。
﹝实验材料﹞载玻片、火柴、吸水纸、生理盐水、各种染色液、菌种（病料）、剪刀、记号笔、普通琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、接种环、酒精灯。 ﹝方法内容﹞
1、器械、病料消毒（剪刀、接种环、病料）—→勾取单菌落—→染色镜检—→划线接种 —→培养。 （1）左手持皿，用左手的拇指、食指及中指将皿盖揭开呈20°左右的角度（角度越小越好，避免空气污染）。
（2）在已培养出单菌落的麦康凯培养基上分别勾取一粉红色单菌落和一淡黄色单菌落，染色镜检，视野均为革兰氏阴性小杆菌或球菌。
（3）右手持接种环，分别勾取粉红色和淡黄色菌涂布于培养基边缘，然后将接种环上多余的材料在火焰中烧毁，带接种环冷却后，再与所涂材料的地方轻轻接触，开始划线。分别标记、编号两个培养基为A和B。
（4）划线前先将接种环稍稍弯曲，这样易和平皿内琼脂面平行，不至划破培养基。 （5）划线中不宜过多的重复旧线，以免形成菌苔。
（6）接种完毕，在皿底上作好菌名、日期和接种者等标记，平皿倒扣，置于37℃培养24h。 注：划线接种于6个普通琼脂平板和6个麦康凯琼脂平板，整个过程无菌操作。 2、G染色：涂片—→干燥—→火焰固定—→染色—→水洗—→干燥—→油镜观察 （1）在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸结晶紫溶液，经1~~2min水洗。 （2）加革兰氏碘液于抹片上媒染，作用1—2min，水洗。 （3）加95%的酒精与抹片上脱色，约0.5—1min，水洗。
（4）加稀释的石碳酸复红（或沙黄水溶液）复染10—30s，水洗。
（5）吸干或自然干燥，镜检。革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
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