四 TSI培养基培养及生化鉴定
﹝目的要求﹞熟悉掌握斜面接种的方法；了解大肠杆菌和沙门氏菌在三塘铁培养基上的培养特性；掌握细菌鉴定中常用生化试验原理和方法；了解细菌生化试验在细菌鉴定及诊断中的重要意义。
1、TSI培养基接种培养
﹝实验原理﹞
本培养基适合于肠杆菌科的鉴定。用于观察细菌对糖的利用和硫化氢（变黑）的产生。该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1，只能利用葡萄糖的细菌，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。而发酵乳糖的细菌(e.coli)，则产生大量的酸，使整个培养基呈现黄色。如培养基接种后产生黑色沉淀，是因为某些细菌能分解含硫氨基酸，生成硫化氢，硫化氢和培养基中的铁盐反应，生成黑色的硫化亚铁沉淀。
﹝方法步骤﹞
勾取A或B菌单菌落—→染色镜检—→斜面接种—→穿刺接种
穿刺接种：用接种针挑取菌落，垂直刺入培养基内。要从培养基表面中部一直刺入管底，然后按原方向退出即可（疑似大肠杆菌和沙门氏菌各接种一管），37℃培养24-48h观察。
结果分析：大肠杆菌在斜面和深层均为黄色，而沙门氏菌在斜面为红色，在深层为黄色，若产生H2S有黑色的沉淀。
2、生化试验
（1）糖发酵实验
原理：各种细菌具有不同的酶，有的细菌能分解某些糖类而产酸产气，有的细菌虽能分解某种糖类，但只产酸不产气，，有的细菌则不能分解。借此特点，可以鉴别细菌。
方法：取两组糖发酵管，将糖发酵管甩至两端，标记后折断，每组将A、B菌接种于两套糖发酵管中，倒立37℃培养24h。
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结果分析：产酸产气时，可使培养基的指示剂变色，并可在发酵管内顶端出现气泡；只产酸时仅见发酵管内培养基颜色改变，不见气泡；不分解者无反应。如大肠杆菌分解乳糖产酸产气；用“⊕”表示，金黄色葡萄球菌虽能分解乳糖，但产酸不产气，用“+”表示；沙门氏杆菌不能分解乳糖，用 “一”表示。
（2）VP实验
原理：某些细菌(如产气杆菌、阴沟杆菌：等)，能分解葡萄糖产生丙酮酸，再进一步将丙酮酸脱羧，变为乙酰甲基甲醇。加KOH溶液后，在碱性环境下，乙酰甲基甲醇被空气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰与培养基内蛋白胨中精氨酸所含胍基发生反应，生成红色的化合物。在培养基中加入少量含胍基的化合物(如叽酸或肌酐等)，可以加速这个反应。在加KOH前，先加入a-萘酚，也可提高试验的敏感性。
方法：取两组葡萄糖蛋白胨水，分别接种A菌和B菌培养管中，经37℃培养48h。加入甲液、乙液各一滴，充分摇动培养管，观察结果。
结果分析：如立即或于数分钟内出现橙红色或红色反应者为阳性。不变色者，将培养管放37℃中4h后再进行观察，若仍不变色或仅呈淡褐色者为阴性。产气杆菌为阳性，大肠杆菌为阴性。
（3）甲基红试验（MR实验）
原理：某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸、丙酮酸再被分解，则可产生甲酸、乙酸、琥珀酸、乳酸等，这样使培养基的pH降至4.5以下，这时加入甲基红指示剂呈红色。甲基红指示剂变色范围pH4.4(红色)一6.2(黄色)。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质(如醇、酮、醛、气体和水等)，则培养基的酸度仍在pH6．2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色为阴性。
方法：将A菌和B菌分别接种在两组葡萄糖蛋白胨水中，在37C培养3～4d，加入MR试剂1～2滴，观察反应结果。
结果分析：红色反应为阳性，无色反应为阴性。例如，大肠杆菌和沙门氏菌为阳性，产气杆菌为阴性。
（4） H2S实验
原理：某些细菌能分解蛋白质中的含硫氨基酸，如半胱氨酸等，生成硫化氢，遇培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色的硫化铅或硫化铁沉淀物。
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方法：将A菌和B菌分别接种于两组硫化氢生化管上，37℃恒温箱中培养18-24h，观察结果。 结果分析：培养基变黑为阳性，不产生黑色为阴性。例如，沙门氏菌多数菌株为阳性，大肠杆菌为阴性。
（5）枸橼酸盐利用试验
原理：枸橼酸盐培养基中的枸橼酸钠是惟一的碳源。有的细菌(如产气杆菌等)可利用枸橼酸盐作碳源，能在此培养基上生长，并分解枸橼酸盐，最后产生碳酸盐而使培养基变为碱性。此培养基中的溴麝香草酚蓝由绿色变为深蓝色，表示枸橼酸盐利用试验阳性。若细菌不能利用枸橼酸盐作为碳源，则细菌不生长，培养基仍保持棕色，表示枸橼酸盐利用试验阴性。
方法：将A菌和B菌分别接种在两组枸橼酸盐生化管上，经37℃培养2—4d后，观察结果。 结果分析：长出菌落，培养基变深蓝色为阳性；细菌不生长，培养基仍为原来的棕色为阴性。例如，沙门氏菌为阳性，大肠杆菌为阴性。
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五 实验结果
1、第二步和第三部菌落观察结果
第一次镜检：视野中充满了红色短杆菌或球菌。 第二次镜检：A菌和B菌均为粉红色短杆菌或球菌。
第一次菌落观察：麦康凯琼脂培养基四周为粉红色中等大菌落，中间一块圆形的小菌落群。第二次菌落观察：A菌菌落为圆形、光滑、湿润、低隆起、粉红色、中等大菌落。 B菌菌落为圆形、光滑、湿润、隆起、淡黄色、小菌落。
2、三塘铁培养鉴定
A菌：从斜面到深层均为黄色，有无色气体产生；
B菌：斜面为黄色，深层为淡黄色，穿刺线有黑色沉淀产生。
3、生化试验结果
表1 分离菌株生化试验结果
菌 种
项目
葡 乳 麦 甘 蔗 H2S MR VP 枸
大肠杆菌 ⊕ ⊕ ⊕ ⊕ ⊕ 一 + 一 一
沙门氏菌 ⊕ 一 ⊕ ⊕ 一 + + 一 ⊕
注：+ 阳性或产酸，⊕产酸产气 ， 一 阴性，R 红色 ，Y 黄色 ，B 黑色
4、结果分析，见第6——第9页结果分析。
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六 讨论与结论
1、通过第一次革兰氏染色，证明了病料中含有革兰氏阴性的短杆菌或球菌；第二次G染色则证
明了成功分离纯化了两种G阴性菌。而A菌菌落在麦康凯上为粉红色菌落，疑似大肠杆菌；B菌菌落在麦康凯上为淡黄色菌落，疑似沙门氏菌。
2、A菌的三唐铁（TSI）培养基培养结果表明A菌能发酵乳糖和葡萄糖并产气，但不产H2S；而
B菌的结果则表明B菌能发酵葡萄糖产酸，产H2S,但不能发酵乳糖。A菌疑似大肠杆菌，B菌疑似沙门氏菌。
3、通过G染色镜检、TSI培养基鉴定、A菌和B菌的生化鉴定结果可以得出结论：A菌为大肠杆
菌，B菌为沙门氏菌。
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