酵母蔗糖酶提取方法的研究
生命科学学院 10级生物科学类 李倩 10197022
指导老师：陶芳
摘要：采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶，通过抽提、30﹪乙醇分级、50﹪乙醇分级和透析，同时测定各步的蛋白质浓度和酶活，并据此计算比活、回收率和纯化倍数。 关键词：蔗糖酶 提取 自溶法
Research on the Extraction Method of Yeast Sucrose
School of Life Sciences， Biological Sciences of grade 2,
li Qian, 10197022
Abstract:The autolysis extract from yeast invertase,through extraction,30
ethanol fractionation and dialysis,simultaneous determination of each step of concertration of protein and enzyme avtivity,and then calculate the radio of live,recovery and purification.
Key words:yeast；extraction；autolysis method
前言：蔗糖酶（Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶（Invertase),1928年Dumas等首先指出酵母菌发酵蔗糖时必须有这种酶的存在，蔗糖在蔗糖酶的作用下，水解为葡萄糖和果糖，还原力增加，又由于生成果糖，甜度增加。
按水解蔗糖的方式，蔗糖酶可分为从果糖末端切开蔗糖的β-D-呋喃果糖苷酶（β-D-frutofuranosidases,EC 3.2.1.26)和从葡萄糖末端切开蔗糖的α-D-葡萄糖苷酶（α-D-glucosidases,EC 3.2.1.20)。前者存在于酵母中，后者存在于霉菌中。工业上多从酵
母中提取。
蔗糖酶在工业上用以转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，还用来制造含果糖和巧克力的软心糖等。
本实验目的在于用自溶法提取酵母蔗糖酶的过程中，测定各步的总蛋白、总活力，并据此计算比活、回收率和纯化倍数。 1.材料与方法
1.1 材料与仪器
1.1.1 材料 酵母粉（市售）。
1.1.2 仪器 离心机；722分光光度计；水浴锅等。
1.1.3 试剂 牛血清蛋白；3，5-二硝基水杨酸试剂；考马斯亮蓝G-250；磷酸缓冲液（0.005mol/L pH6.0)等。 1.2 方法
1.2.1 蔗糖酶粗品的制备
将5g酵母粉倒入500ml烧杯中、少量多次地加入15ml蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入0.5g乙酸钠、8ml乙酸乙酯，搅匀，再于35℃恒温水浴中搅拌30min。补加10ml蒸馏水后，搅匀盖严，35℃恒温过夜后，4000r/min离心10min,得到的上清液即为粗制酶液。 1.2.2 葡萄糖标准曲线的制作
在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系，可用于比色测定。采用DNS比色法测定还原糖的含量，同时可测定酶活。
取葡萄糖标准品，用缓冲液配置成一定梯度浓度的溶液，与DNS显色后在520nm测定吸光值。
表1 葡萄糖浓度标准曲线的制作
项目 含糖总量mg 葡萄糖液ml 蒸馏水ml DNS试剂ml
加热 冷却 蒸馏水ml 光密度OD520nm
20
20
空白 0 0 2.0 3
1 0.8 0.4 1.6 3
2 1.2 0.6 1.4 3
3 1.6 0.8 1.2 3
立即用流动冷水冷却 20
20
20
20
20
4 2.0 1.0 1.0 3
5 2.4 1.2 0.8 3
6 2.8 1.4 0.6 3
均在沸水浴中加热5min
以葡萄糖含量（mg)为横坐标、吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，获得的葡萄糖标准曲线回归方程为：y=0.0746x+0.0024。 1.2.3 蛋白质标准曲线的制定
采用考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质浓度。
取标准牛血清蛋白，用生理盐水配置一定梯度浓度的系列标准蛋白液，与G-250作用后在595nm测定吸光值。
表2 蛋白质定量测定标准曲线制作
溶液 系列标准蛋白液ml 实际蛋白质含量μg 0.9%生理盐水ml 蛋白质染色液ml
0管 _ _ 1.0 5.0
1管 0.2 20 0.8 5.0
2管 0.4 40 0.6 5.0
3管 0.6 60 0.4 5.0
4管 0.8 80 0.2 5.0
5管 1.0 100 _ 5.0
留样1 0.5 _ _ 5.0
留样1’ 0.5 _ _ 5.0
轻轻摇匀，5min后以0号管调空白，595nm分光光度法测光密度值，汇出标准曲线。
未知样品从标准曲线上查出相应浓度 经测定，得
表3 蛋白质含量与光密度值测定结果
试管号 0 1
实际蛋白质含量（mg) _ 20
2 3 4 5 40 60 80 100
OD(595) 0 0.142 0.355 0.455 0.654 0.787
以蛋白质含量（mg)为横坐标、吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
获得的蛋白质曲线方程为：y=7.945x+0.0019。从上述公式可知，吸光值和蛋白质含量呈正相关。
1.2.4蛋白质浓度测定
从留样中取0.3ml加0.9%的Nacl 稀释至3ml,再按以下表格操作测定
表4 蛋白质浓度OD值
溶液 对照组 留样 系列标准蛋白液/ml — 0.5 0.9%生理盐水/ml 1.0 0.5 蛋白质染色液/ml 5.0 5.0
1.2.5 蔗糖酶活的测定
取5%的蔗糖、酶液5ml分别于35℃水浴中预热5min[若酶浓度过高，用0.02mol/l的醋酸缓冲液（PH=4.7）适当稀释］。
表6 蔗糖酶水解蔗糖
试管 0 1
5%蔗糖 2 2 1mol/lNAOH(ml) 0.5 酶液（ml）
2 2
0.5
35℃水浴，3min
1mol/lNAOH(ml)
表7 还原糖的测定
试管 0
1
2
反应液(ml) 0.5 0.5 0.5
(取自表1中0管) (取自表1中1管) (取自表1中1管)
DNS试剂(ml)
水(ml)
3
3
3
1.5 1.5 1.5 沸水浴5min后，立即流水冷却
水(ml) 20 20 OD(520)
20
在该条件下，每3ml释放1毫克还原糖所需的酶量，定义为一个活力单位。
1.2.5 粗酶的乙醇分级分离和透析
先测定所提粗酶液的pH,用10%的HAC调pH至4.5（注意少量、慢加、搅匀，防止调过。），共加入约0.6ml的HAC。
调好pH的粗酶液在不断搅拌下缓慢滴加6.7ml无水乙醇，使其质量分数达30%，4000r/min离心10min,取上清液，留样2ml。剩余上清液追加无水乙醇使其质量分数达50%，4000r/min离心10min,沉淀立刻用10ml 1/150mol/L pH6.0的磷酸buffer溶解，并装入透析袋过夜。次日，将透析液4000r/min离心10min,取上清液。
1.2.6 计算公式
酶活力单位=G毫克数×9×15/2
酶活（u/ml)=酶活力单位u÷0.1ml
蛋白质浓度（mg/L）=x mg×3／0.5×1／0.3 2.结果与分析
2.1 蛋白质测定结果基本数据
表8蛋白质含量测定表
试管
OD595
E1 E2 E3