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2.2.1.5 双亲和重靶向分子（DARTs）
DARTs是将第一个可变区的VH与第二条链的VL连接，同时将第二可变区的VH与第一条链的VL连接形成一个VLA-VHB+VLB-VHA型式的复合物[22]。链间引入二硫键来增加抗体的稳定性[22]。DARTs由于尺寸较小导致其容易被机体清除。为了避免这种情况，MacroGenics在DARTs上融合了一个Fc片段以延长其血清保留时间[23]。
2.2.2 纳米抗体（Nanobodies）
纳米抗体是天然形成的最小的抗体，它只有重链部分（15kDa)[24]。纳米抗体可以在缺少轻链的情况下与相应的抗原结合。来自美洲驼和骆驼的具有不同结合特异性的纳米抗体已经被短链连接起来形成bsAbs[25]。
2.2.3 Dock-and-lock(DNL)方法
将抗体片段与异型二聚化蛋白（如cAMP依赖性蛋白激酶（PKA）和A激酶结合蛋白（AKAP））进行融合。当蛋白质形成异型二聚体后，就行成了双特异性抗体[26]。
2.2.4 其它双特异性或多特异性分子
ScFvs还可以连接到其他分子如细胞因子TNF-α（天然的TNF-α以三聚物的形式存在）、胶原蛋白XV或XVIII的三聚结构、拉链二聚作用域(Fos或Jun)来生成多价分子[6]。
2.3 延长半衰期策略
基于单链抗体的bsAbs有很多优势，比如易于制造，组织渗透力强，此外，他们还可以与完整抗体因空间位阻不能结合的抗原表位进行结合。进一步说，他们因缺少Fc区域而具有更低的免疫原性，从而避免被FcR所吸收。但是，基于单链抗体的bsAbs由于其半衰期短也导致了几个缺点，如血液清除快、fast offrates和针对靶点（如肿瘤）保留时间短。在临床应用中，血清半衰期短的药物需增加给药频率和量[27]。因此，延长血清半衰期在经济和治疗两方面都有益。有几种策略可以延长bsAbs的血清半衰期，如:
2.3.1 聚乙二醇化
附加高度灵活、亲水的分子如PEG可以增加bsAbs的体积，从而提高他们的血清半衰期。然而，附加PEG的数量和尺寸链会导致抗体部分失活或亲和力降低[28]。定点结合一个单链PEG链的方式似乎是一个理想的策略[27]。
2.3.2 与人血清白蛋白或半结合清蛋白融合
将scFvs与HSA或半结合清蛋白融合可以延长其的血清半衰期。此外，HSA与FcRn相互作用不会改变抗原结合的亲和力。这种策略被抗体工程师广泛采用。抗体与白蛋白融合
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/结合后不仅增加了其分子的大小，还能促进bsAbs再利用，延长半衰期。白蛋白被细胞吸收后，会首先与早期内涵体上的FcRn结合，从而避免被破坏。然后，白蛋白被重新运送到细胞质膜并释放到血浆[27]。梅里马克公司（Merrimack）采用这个方法成功开发出MM-111。Ozoralizumab(ATN-103，Ablynx)是一种来自于骆驼的重链制成的分子量为38kDa的三价双特异性纳米抗体。理论上，这样的小分子药物容易被肾脏清除。为了解决这个问题，ozoralizumab被设计成与HAS结合，保留了其结合TNF-α[29]的特异性。
2.3.3 与Fc片段融合
一些抗体工程师将Fc片段与基于单链抗体的bsAbs融合。Fc的片段不仅提高了分子的大小，还能通过FcRn促进再利用。MacroGenics开发出Fc-bearing DART MGD007用于治疗结肠癌患者。
2.3.4 多聚化
多聚化是另一个通过调整大小和结合力来优化bsAb半衰期的策略。
3 BsAbs的临床应用
3.1 BsAbs重定向免疫效应细胞以缩短其与肿瘤细胞的距离
细胞毒性T淋巴细胞在对抗癌症细胞的免疫反应中发挥着重要作用[30]。然而，在免疫反应过程中，肿瘤特异性T细胞反应往往受限于被肿瘤细胞利用的免疫逃逸机制。免疫疗法在过去几年中的进展已经可以克服这一挑战。一个利用免疫细胞的策略是利用bsAbs来杀死肿瘤细胞。几个正在进行临床实验的bsAbs被设计成将T细胞重定向至肿瘤细胞[31]。这个过程伴随着在T细胞和肿瘤细胞间形成临时的溶细胞突触。随后T细胞的激活和增殖导致肿瘤细胞被裂解[32]。除了T细胞，其他免疫细胞如巨噬细胞、单核细胞、粒细胞、自然杀伤(NK)细胞也被用于杀死肿瘤细胞。许多bsAbs包括Triomab、BiTR、DART及FynomAb为病人提供了新的治疗手段。
3.1.1 Triomab抗体将T细胞重定向至肿瘤
采用小鼠/老鼠杂交瘤细胞生产的Triomab抗体产量和纯度都很高。目标bsAbs与许多副产物混合在一起，比如单特异性抗体，以及轻链错配等，都将增加纯化的难度。分别来自老鼠和小鼠的轻重链会优先配对，可将轻重链错配比例下降至4%~10 %[33]。这种bsAbs可以方便的使用Protein A纯化[5]。Triomab抗体具有三重功，一条臂用于结合肿瘤相关抗原；第二臂用于结合T细胞上的CD3；Fc区域可以优先识别辅助细胞（如巨噬细胞、树状
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细胞和NK细胞）上的I(CD64)、IIα(CD32a)，III Fcγ(CD16)受体。随后T细胞被激活，并释放T细胞因子如TNF-α和IFN-γ。此外，FcγR阳性辅助细胞被重定向到肿瘤细胞并释放的高水平的促炎细胞因子如IL-6、IL-12、GM-CSF及DC-CK1[34]。通过T细胞介导细胞裂解、ADCC以及活化的辅助细胞的吞噬作用使肿瘤细胞裂解[9](图2)。
图2 Triomab?抗体将T细胞和其他辅助细胞重定向至肿瘤细胞
Catumaxomab是首次被批准用于癌症治疗的Triomab bsAb。它通过在一个宿主细胞中共表达老鼠IgG2b和小鼠IgG2a生产出来。与BiTE相比，IgG样 bsAb具有更长的血清半衰期。病人在9~13天内接受4到5次腹腔注射给药10 - 150μg后[8]，大多数病人对Catumaxomab都表现出可接受的体液免疫反应，这种抗药反应有利于临床结果。这种保护依赖于catumaxomab嵌合Fc区域导致的免疫原性反应[9]。可能得不良反应包括短暂发热、恶心和呕吐。大多数不良事件可能归因于细胞因子释放相关症状，并且是可逆的[9]。Catumaxomab被欧盟批准用于治疗标准疗法无效的EpCAM阳性癌症患者。Catumaxomab目前正在进行卵巢癌、胃肠道癌症、非小细胞肺癌、乳腺癌和腹膜癌的临床实验[35]。
其他Triomab成员还有ertumaxomab和FBTA05。Ertumaxomab靶向HER2/neu，一个已被证实的乳腺肿瘤生物标志物。通过将T细胞重定向至HER2/neu过表达的细胞，ertumaxomab可以杀死肿瘤细胞，即使细胞表面表达HER2/neu较低，也同样有效[36]。在I期临床研究中，15个接受ertumaxomab治疗的转移性乳腺癌患者中，有5个显示了抗肿瘤反应[37]。FBTA05特异性的结合B细胞上的CD20和T细胞上的CD3，该药正在针对CD20阳性B细胞恶性肿瘤患者进行I/II期临床实验[38]。
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3.1.2 BiTEs将T细胞重定向至肿瘤细胞
BiTE平台用来开发串联单链型bsAbs。Blinatumomab可同时与T细胞上的CD3和表达CD19的B细胞恶性肿瘤[39]。这是美国FDA批准的第一bsAb，分子量55KDa，用于治疗急性B淋巴细胞白血病细胞[40]。此外，用于治疗急性淋巴细胞白血病(ALL)正处于II、III期临床实验阶段，用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)正处于II期临床实验阶段，用于治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)正处于I期临床实验阶段。Blinatumomab能将T细胞运输至肿瘤细胞并显示出强大的肿瘤杀伤能力(图3)。大量汇集的各种蛋白酶原为在T细胞和靶细胞间形成形成溶细胞突触提供了基础的组分[41]。与此同时，T细胞开始增殖并释放细胞因子如TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-2、IL-4和IL-10[42]。BiTE分子在极低浓度10-100pg/ml时都具有强大的重定向T细胞至CD19阳性淋巴瘤细胞的能力。体内剂量> 15μg / m2/天时将导致肿瘤细胞死光。Blinatumomab的血清半衰期小于2 h。病人通过一个注射接口系统注入BiTE并观察3 - 7天。在II期临床实验中，在高复发或难治性淋巴细胞白血病患者中获得了43%的完全应答率，中位生存期达6.1个月[23]。Blinatumomab也有一些缺点，因为有些病人患有神经毒性，因此而显示出细胞因子释放综合症的症状[23]。由于其体积小，blinatumomab可以很容易地被肾脏清除，因此患者需要每48小时更换输液袋[32]。应该注意的是，一些患者接受blinatumomab后会产生耐药性[43]，产生耐药性的机制包括但不限于，CD19亏损、骨髓复发、肿瘤细胞上调程序死亡受体1[43]。
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图3 BiTE?抗体重定向T细胞至肿瘤细胞
除了blinatumomab之外，其他一些BiTE如solitomab(抗CD3和EpCAM，用于治疗实体瘤，完成I期临床研究)，MEDI-565(抗CD3和CEA，用于治疗胃肠道腺癌，完成I期临床研究)，BAY2010112(抗CD3和PSMA，用于治疗前列腺癌，正在进行I期临床研究)也正在研究中[44]。
3.1.3 DARTs将T细胞重定向至肿瘤细胞
DART技术采用小的连接肽，以增加bsAbs的稳定性和降低免疫原性。和BiTE不同，DARTs两条链间的共价连接限制了抗原结合位点的自由度。因此，DARTs的结构紧凑，可以在目标和感受细胞间形成稳定的接触。Moore等证明了CD19×CD3 DART在重定向并杀死B细胞淋巴瘤方面比BiTE分子更有效[22]。产生这种结果的原因可能是DART型式的抗体对CD3有更高的亲和力以及对CD19的解离速率常数低[45]。然而，只有一个研究进行并行对比，很难得出哪种型式比较好的结论。需要更多的临床试验来评估DART和BiTE间哪