固定化技术及其应用
摘要 固定化细胞技术是酶工程的核心技术之一，它将酶工程提高到一个新水平。该技术简化了工业分离纯化的步骤，并使酶反应的连续生产成为现实。目前，该技术已经广泛应用于食品、发酵、三废处理等行业，经济效益显著。首先分析了固定化细胞的优缺点，介绍了近年来在食品、发酵和三废处理行业的应用，最后对其应用进行了展望。 关键词 固定化酶；食品；发酵；三废处理；应用 引言
固定化细胞就是被限制自由移动的细胞，既细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具备能被反复或连续使用的活力。是在酶固定化基础上发展起来的一项技术。【1】
固定化微生物技术使用化学或物理手段，将游离细胞或者酶定位于限定的区域，使其保持活性并可反复利用的方法。最初主要用于发酵生产，70年代后期，被利用到水处理领域，近年来则成为各国学者研究的热点【2】。固定化微生物技术克服了生物细胞太小，与水溶液分离较难，易造成二次污染的缺点，保持了效率高、稳定性强、能纯化和保持高效菌种的优点，在废水处理领域有广阔的应用前景。在实际应用过程中，如何固定、何种载体，才能使固定化微生物能较长时间的保持一定的强度和活度，才能降低固定化成本，延长固定微生物的使用寿命，是该技术在污水处理中得到广泛应用的关键。 固定化技术作为实现动物细胞大规模培养的重要途径, 相对悬
浮培养而言具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强、产物易于收集和分离纯、对贴壁型和非贴壁型细胞【3】都适用的优点, 因此在动物细胞的大规模培养上得到越来越广泛的应用,相继出现了微载体、中空纤维及微囊化等多种固定化培养技术。本文作者将结合动物细胞的培养特性,介绍目前动物细胞大规模培养中的固定化技术。 酶作为一种蛋白质，其催化活性与空间结构密切相关，在大多数情况下固相酶的催化活性较低，以固定化氨基酰化酶为例，选择比较好的载体材料和固定化方法，其活性一般也仅为游离酶的50％ ～60％ 。而固定化细胞是将动植物或微生物细胞固定于合适的不溶性载体上的一种技术，它可以提高生产效率，延长生产周期，并易于细胞的分离和回收。目前，固定化细胞技术已应用于食品工业、发酵工业和三废处理工业，经济效益显著【4】。 1.固定化技术发展 1.1 固定化技术起始
1953年，德国的格鲁布霍费（Grubhofer）和施莱思（Schleith）首次制成固定化酶。
1969~1973年，日本的千畑一郎首次在工业生产上连续生产L-氨基酸、L-天冬氨酸，开创了固定化酶和固定化微生物细胞应用于工业生产的先例；
1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精。 1.2 固定化技术现状
在工业上使用的固定化酶还仅限于葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶
和青霉素酰化酶等为数不多的十几个酶种，仍需大力研究开发使更多的固定化酶和细胞能适用于工业规模生产 2. 固定化技术方法论
固定方法很多，常用的有吸附法、包埋法、结合法和交联法。 1）吸附法（adsorption）：可分为物理吸附法和离子吸附法。 ◆ 物理吸附法（physical adsorption）：通过物理方法直接吸附在水不溶性载体（纤维素、淀粉、面筋、活性炭、多孔玻璃、硅胶等）表面而固定化的方法，是固定化最早采用的方法。
◆ 离子吸附法（ion adsorption）：通过离子键与载体相结合的固定化方法。常用载体有DEAE-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、CMC等。吸附容量一般大于物理吸附法。
2）包埋法（entrapment）：包埋在各种多孔载体中，固定化的方法。根据载体材料的不同，可分为凝胶包埋法和微胶囊包埋法。 ◆ 凝胶包埋法：包埋成网格型。常用的载体有天然凝胶、合成凝胶或树脂等。
◆ 微胶囊包埋法：包埋成微胶囊。常用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋酸纤维素等。
3）结合法(binding）：与聚合物载体以共价键或离子键结合的固定化方法，是固定化研究中最活跃的一大类方法。
4）交联法（cross-linking）：借助双功能试剂使酶分子之间相互交联呈网状结构的固定化方法。应用最广泛的双功能试剂是戊二醛。
3.固定化特点 3.1、优点：
1）无需进行酶的分离纯化，大大降低成本；2）提高了酶的稳定性和对污染的抵抗力；3）细胞生长停滞时间短，反应快。 3.1.1固定化微生物细胞的特点
1、保持了细胞的完整结构和天然状态，稳定性好，可按照原来的代谢途径进行新陈代谢，并进行有效的代谢调节控制。
2、发酵稳定性好，可以反复使用或者连续使用较长的一段时间。 3、密度提高，可以提高产率。 3.1.2固定化植物细胞的特点
1、由于有载体的保护作用，可提高植物细胞的存活率和稳定性。 2、细胞被束缚在一定的空间范围内进行生命活动，不容易聚集成团。 3、可反复使用或连续使用较长的一段时间，大大缩短生产周期，提高产率。
4、易于与培养液分离，利于产品的分离纯化，提高产品质量。 3.1.3固定化动物细胞的特点
1、由于有载体的保护作用，可提高动物细胞的存活率。
2、动物细胞固定化后，可先在生长培养基中生长繁殖，使细胞在载体上形成最佳分布并达到一定的细胞密度后，转移至发酵培养基，控制发酵条件，使细胞从生长期转变到生产期，以利于提高产率。 3、可反复使用或连续使用较长的时间。
4、易于与产物分开，利于产物分离纯化，提高产品质量。
3.1.4固定化原生质体特点
①由于解除了细胞壁这一扩散屏障，可增加细胞膜的通透性，有利于氧气和营养物质的传递和吸收，也有利于胞内物质的分泌，可显著提高产率。
②由于有载体的保护作用，具有较好的操作稳定性和保存稳定性，可反复使用和连续使用较长的时间，利于连续化生产。在冰箱保存较长时间后仍能保持其生产能力。
③易于和发酵产物分开，有利于产物的分离纯化，提高产品质量。
④发酵的培养基中需要添加渗透压稳定剂，以保持原生质体的稳定性。这些渗透压稳定剂在发酵结束后，可用层析或膜分离技术等方法与产物分离。 3.2、缺点
1）固定化酶的活力有所损失；
2）必须保持菌体的完整，需防止菌体的自溶；
3）载体、细胞膜或细胞壁会造成底物渗透与扩散的障碍。 4.固定化反应器：
4.1搅拌罐型反应器：分类：包括分批搅拌罐式反应器（BSTR）和连续流搅拌罐式反应器（CSTR）。 连续流搅拌罐式反应器在运转过程中，底物以恒定的流速流入反应器，与此同时，反应液则以同
样的流速流出反应器。反应桶内装有搅拌器，使反应组分与固定化酶颗粒混合均一，出口处有过滤膜，可使不断补充新鲜底物与反应