一 目的基因的获得 细菌基因组DNA的提取 （一）仪器 1）台式高速离心机 2）恒温水浴箱 3）枪式移液器 4）灭菌的EP管和Tip头 （二）试剂
1）溶液1: 25% 蔗糖
50mmol/L Tris-Hcl，pH8.0 50mmol/L EDTA，pH8.0 500ug/ml 溶菌酶（现用现配） 100ug/ml RNase
2)溶液Ⅱ：100mmol/L Tris-Hcl，pH8.0 1% SDS 400ug/ml 蛋白酶K 3）酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 4）氯仿：异戊醇（24：1） 5）3mol/L NaAc(pH5.2) 6）异丙醇或无水乙醇 7）70%乙醇
8) TE缓冲液： 10mmol/L Tris-Hcl，pH8.0 1mmol/L EDTA，pH8.0 (三)实验步骤
1) 5mL细菌过夜培养，5000rpm离心10分钟，去上清液。 2）将菌体细胞悬于250uL溶液1中，37°C水浴保温过夜。 3）加250uL溶液Ⅱ，55°C水浴保温4小时。
4）加0.9倍体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤4一次。
5）向转移的水相中加入0,9倍体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10
分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤5一次。
6）向转移的水相中加入0.1倍体积的3mol/L NaAc和0.7倍体积的异丙醇（或2.5倍体积的无水乙醇），冰上放置30分钟。
7）14000rpm离心20分钟，弃上清，用0.5mL70%乙醇洗涤沉淀一次，弃上清，沉淀于室温干燥。
8）将DNA沉淀溶解于15ul TE缓冲液中，-20°C保存。 9）进行DNA含量和纯度检测，琼脂糖凝胶电泳鉴定。
植物DNA的SDS提取法： （一）试验试剂：
1）研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH 调至pH7.0，并定容至1000ml。
2）10 SSC溶液：称取87.66gNaCl 和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。 3）1 SSC溶液：用10 SSC溶液稀释10倍。 4）0.1 SSC溶液：用1 SSC溶液稀释10倍。
5）Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl 溶液配制成25mg/ml 的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。 6）氯仿－异戊醇：按24ml 氯仿和1ml 异戊醇混合。
7）5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O 70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。 8) SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。 9) 1mol／LHCl。 10) 0.2mol/LNaOH。
11) 二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml 冰醋酸中，添加1.5ml 浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml 乙醛液［浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）］。 12) 1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。 13) 0.05mol/LNaOH。
14) DNA标准液：取标准DNA25mg 溶于少量0.05mol/L NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml 至50ml 容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml 的标准溶液。 （二）实验步骤：
1) 称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml 预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。
2) 将匀浆无损转入25ml 刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。
3) 离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。
4) 将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液［提取液：高氯酸钠溶液＝4：1（V／V）］，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。
5) 再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。
6) 用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。 7) 然后加入0.5ml 左右的10 SSC，使最终浓度为1 SSC。 8) 重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。
9) 加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min，以除去RNA。
10) 加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。 11) 再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。
二、PCR扩增目的基因
(一)器材 1) 微量移液器
2) 灭菌的Tip头、PCR管 3) PCR扩增仪
4) 目的DNA（DNA模板） 5) dNTP混合物 6) 引物对 7) Tap酶
8) PCR扩增试剂盒 （二）试剂
1）10×PCR 缓冲液（含Tris-HCl 100mmol/L; MgCl2 15mmol/L、KCl 500mmol/L, pH8.3，0.1%明胶）
2) 脱氧核苷三磷酸dNTPs：配成 10mM—— dATP，dTTP，dGTP，dCTP各10mM，用NaOH溶液调节至pH8.3。）
3）氯仿-异戊醇：配成24：1的比例，室温避光保存。 4) 酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 5) 3M NaAc 、ddH2O 6) 无水乙醇：70%乙醇 7) TE缓冲液 （三）实验步骤
1）在0.2ml薄壁反应管中加入下列成份：（混匀）
ddH2O: 补至终体积（25μl） 10×PCR缓冲液 1/10总体积 2.0mM dNTPs 1μl
2U/μl Taq DNA聚合酶 0.5μl
引物混合液（10 pmol /μl /引物） 1μl DNA模板 0.6μl
混匀后，在台式离心机上瞬时离心10秒。 2）在设定好的PCR仪上反应
95°C，5min；95°C，1min；56°C，1min；72°C，2min。反应30轮。
3）反应结束后，将反应管在72°C充分延伸10分钟，再将反应管冷却至4°C。 取一部分反应液进行琼脂糖凝胶电泳(实验三)，确认是否有目的的PCR产物。如果PCR产物纯度较低或反应液中含有连接反应阻碍物，可以通过纯化得到改善。纯化继续4）—6）。 4）转至1.5ml离心管，向管中加25μl酚，25μl氯仿-异戊醇混匀，离心10000rpm，30秒。 5）吸取上层液，转至另一已加5μl 3M NaAc的1.5ml的离心管，加150μl无水乙醇，-20°C
过夜。
6）离心10000rpm，10分钟，弃上清，加0.5ml 70%乙醇，10000rpm离心，5分钟。弃上清，烤箱中干（60°C），溶于20μl TE。 （四）技术要点
1）PCR各组份的配制与加样量要特别注意。
(1) 引物浓度：10 pmol 足够30个循环，浓度太高导致与模板非特异结合增强，扩增非 特异片段增多，浓度太低则扩增效率低。
(2) 引物的配制：厂家提供的引物一般是干粉状态并标明OD值，1 OD约含33μg。开盖前先将干粉离心至管底，加双蒸水至浓度2μg/μl，再取部分稀释至10 pmol /μl。 引物浓度计算公式：1pmol=(3.3×10μg) ×n ，n是引物的碱基数
(3) Mg：使用浓度一般在1.5mM，要求模板不含高浓度EDTA和诸如硫酸基团类的负电荷基团， Mg浓度升高可导致错配率升高和非特异性扩增。
(4) 模板DNA：浓度不可过高，质粒DNA 20ng即可，若需第二次扩增，可将第一次扩增产物稀释1000-10000倍作为模板使用。
(5) Taq DNA聚合酶：一般用量5U/100μl。酶量过大易导致扩增非特异序列，Taq酶具有末端转移酶活性，常在3’端加A。 2）扩增轮数与退火温度
扩增轮数：一般30轮以内就可使模板扩增10倍，超过30轮，错配率升高。 退火温度计算公式：Tm值=（GC×4+AT×2）–4
6
-4
2+
2+