六、大肠杆菌感受态细胞的制备及目的DNA的转化
(一)仪器
1．小型高速离心机 2．恒温摇床 3．恒温培养箱 4．‐20℃冰箱 5．恒温水浴器 6．超净工作台 7．高压灭菌锅 (二)材料 1．氨苄青霉素 2．大肠杆菌DH5a 3．连接产物 4．离心管
5．枪头、微量移液器 6．试管、培养皿、三角瓶 (三)试剂
LB 培养基（根据需要确定配制的量）：
10g/L 胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，加水至1000ml，高压灭菌，保存在室温。 氨苄青霉素：
用去离子水配成100mg/ml的储存液，过滤除菌，－20℃分装保存。 卡那霉素：
用去离子水配成100mg/ml的储存液，过滤除菌，－20℃分装保存 无抗生素LB琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）：
10g/l 胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l NaCl，15g/l 琼脂粉，加水至1000ml，高压灭菌；铺平板，冷却后在37℃培养24小时，保存在室温。
含有抗生素LB琼脂糖平板培养基（根据需要确定配制的量）：
10g/l 胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l NaCl，15g/l 琼脂粉，加水至1000ml，高压灭菌；当培养基降温至50℃左右，加入终浓度为100μg/ml 的氨苄青霉素或50μg/ml卡那霉素，并铺平板，冷却后在37℃培养24小时，保存在室温。
0.1 M CaCl2（根据需要确定配制的量）：
11.099克溶解在1000ml灭菌水中，0.22μm滤器过滤除菌。氯化钙分子量为：110.99。 50％甘油：
50ml甘油加入50ml水，混匀，高压灭菌。 其他：
DH5α大肠杆菌，灭菌玻璃平皿若干，接菌环，加250ml LB液体培养基的1000ml灭菌锥形瓶一个，灭菌50ml和500 mL离心管若干，灭菌刻度吸管若干，冰盒，移液器，灭菌移液器吸头，灭菌Eppendorf管等。 （四）实验步骤
1）以接菌环从－70℃保存的高效转化菌种中蘸取少量菌液划无抗生素平板，培养12小时； 2）挑取单菌落接种于5 mL无抗生素LB培养基中，37℃振荡培养过夜；
3）按照1:100接种菌液至250 mL LB培养基中，37℃剧烈振荡培养1.5-2 小时左右，至OD600达0.4-0.6；
4）将菌液冰浴10 分钟，转移至预冷的500 mL离心管中，4℃，4000 rpm离心10 分钟； 5）弃上清，将细菌沉淀重新悬浮于50 mL预冷的0.1 M CaCl2中，冰浴20 分钟，4℃，4000 rpm离心10 分钟；
6）弃尽上清。以12.5 mL（菌液体积的5％）预冷的0.1 M CaCl2溶液重悬细菌沉淀，同时加入等体积预冷的50%甘油水溶液，混匀后按每支50μL在冰上分装，－80℃保存； 注：以上操作全部在无菌条件下进行。
7）取连接产物2μl（在实际操作中，经常需要取全部连接产物）置于冰上； 8）从－80℃冰箱取3管感受态细菌（每管50μl），在冰上融化；
9）将连接产物加入感受态细菌中，混匀，放置冰上20－30分钟；同时做两个对照管
? 受体菌对照：50μl感受态细胞+2μl无菌水 ? 质粒对照：50μl0.1 M CaCl2溶液+2μl连接产物 10）42℃加热90秒，迅速置于冰上1－2分钟；
11）每管加入400－1000μl的无抗生素液体LB培养基，在37℃摇床缓慢摇荡20－60分钟； 12）用<10000rpm离心10秒，弃去大部分上清，留下约50μl并用移液器吹吸重悬细菌； 13）取适量细菌悬液均匀的涂布在带有相应抗性（根据质粒所携带抗生素抗性基因而定）的LB琼脂糖平板上，倒置于37℃培养箱培养12小时以上，出现菌落。
（五）技术要点
1．加入的连接产物体积应该小于感受态细胞体积的5％； 2．42℃热激时，必须要保证温度的准确性；
3．涂布LB平板的菌液量应该根据经验确定。如果连接效率很高，而且所用感受态细菌的效率也很高，则吸取较少量的菌液；反之，可以增加，甚至全部菌液涂布平板。判断的标准：在LB平板上生长密度合适的单菌落；
4．涂布平板之后，在37℃培养的时间不超过12－16小时，否则可能产生卫星菌落； 5．防止其它质粒污染； 6．防止其它细菌污染。
七、质粒DNA的提取及重组子的鉴定
(一)仪器 1．恒温培养箱 2．恒温摇床 3．小型高速离心机 4．高压灭菌锅 5．分光光度计 （二）试剂及材料 1.转化重组子
2.缓冲液A：50mM葡萄糖；10mM EDTA；25mM Tris-HCl，pH8.0。 3.碱溶液：0.2M NaOH; 1%SDS, PH12.5。
4.乙酸缓冲液：3M NaAC；2M乙酸，pH4.8（盐酸调pH）。 5.TE缓冲液：10mM Tris-HCl，pH8.0；1mM EDTA.。
6.RNA酶A溶液：10mg/ml RNA酶 A，用TE配制，100°C煮10分钟，灭活DNA酶。缓慢冷却至室温，10000r/min离心5min,上清于-20°C保存。
7.LB培养基: 10g胰蛋白胨，5g酵母粉，5g NaCl加水至1000ml，用1M NaOH调pH至7.5，高压灭菌。
8.氨苄青霉素：用去离子水配成100mg/ml的储存液，过滤除菌，－20℃分装保存。 9.LA培养基: 在LB培养基中加入终浓度100μg/ml的氨苄青霉素。 10.异丙醇
11.酚-氯仿-异戊醇：25：24：1 12.70%乙醇 13.3M NaAc （三）实验步骤
1） 从转化平皿上挑一克隆接种到LA液体培养基中，37℃震荡培养，待细菌浓度增至OD600=1—1.2时，收获细菌。菌液转到1.5mlEppendorf管中，离心8000rpm，2分钟，弃上清。
2）加100μl缓冲液A，充分混悬细菌。
3）加200μl碱溶液，裂解细菌，反复倒转管5次至溶液清亮，开盖后能拉出丝状粘稠液体。 4）加150μl乙酸缓冲液，反复倒转管5次，混匀，冰浴10分钟。
5）离心10000rpm，5分钟，将上清转移至另一Eppendorf管中。
6）加等体积的酚-l氯仿-异戊醇（25：24：1）混匀，离心10000rpm，1分钟。 7）吸上层水相至另一Eppendorf管中，加等体积的氯仿混匀，离心10000rpm，1分钟。 8）吸上层水相至另一Eppendorf管中，加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温或-20°C，10分钟。
9）离心10000rpm，10分钟，弃上清，加入1ml 70%乙醇。勿混匀，离心10000rpm，5分钟，重复加入1ml 70%乙醇一次，弃上清，干燥箱中干燥。
10）干燥后，加入30μl TE（含RNA酶A 10ul，20μg/ml），使质粒溶解，-20°C保存备用。 11) 取一个灭菌的EP管，依次加入下列试剂
10×限制酶缓冲液2.0ul、重组质粒5.0ul、ddH2O 11.0ul、限制性内切酶2.0ul总体积为20.0ul。
12）将上述试剂轻轻混匀，稍加离心，集中溶液，37°C水浴保温3—4小时。酶切结束时，加入0.5mmol/L EDTA(PH8.0)使终浓度达10mmol/L，以终止反应。 13）质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析详见实验三。 （四）技术要点
1）每一步都要充分混匀，为获得高产量DNA，第一步需使菌体完全重悬。
2）加入碱溶液后，反复混匀使细菌充分裂解，但需要轻柔，一旦裂解（液体变清亮）必须马上加乙酸缓冲液中和。
3）70%乙醇洗涤时，离心后应小心地将上清倒掉，注意这时DNA沉淀较疏松，易从管壁上脱落。