16O1098R473116135OH2312415CH2R2R1OHR
图9-3 单端孢霉烯族化合物的结构
到目前为止，从真菌培养物及植物中已分离出化学结构基本相同的单端孢霉烯族化合物148种。根据相似的功能团可将其分为A、B、C和D四个型。A型的特点是在C-8上有一个与酮不同的功能团，这一型包括T-2毒素和二醋酸薰草镰刀菌烯醇（DAS）.B型在C-8上有一羧基官能团，以脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON） 和雪霉腐镰刀菌烯醇（NIV） 为代表。C型的特点是在C-7，8或C-9，10上有一个次环氧基团。D型在C-4和C-5之间有两个酯相连。天然污染谷物和饲料的单端孢霉烯族化合物有A型中的T-2毒素、二醋酸薰草镰刀菌烯醇和B型的脱氧雪腐镰刀菌烯醇、雪霉腐镰刀烯醇。
TCTCs为无色结晶，该化合物非常稳定，难溶于水，溶于极性溶剂，在烹调等加热过程中不会被破坏。在紫外线下不显荧光。 9.3.2.2 单端孢霉烯族化合物的来源
镰刀菌属的菌种广泛分布于自然界，从土壤中可分离到50多种镰刀菌，世界各地均有污染。这些真菌及其毒素主要侵害玉米、小麦、大米、燕麦、大麦等谷物。
9.3.2.3 单端孢霉烯族化合物的毒性及在食品中的限量标准
TCTCs的共同毒性特点是较强的急性毒性、细胞毒性和致畸作用，对人和动物有较强的致呕吐作用。还可损伤细胞膜，有较强的蛋白质合成抑制作用，可致免疫力低下。某些TCTCs有一定的致癌性。
T-2毒素能在不同细胞系中诱发染色体畸变，增加姐妹染色单体交换频率和微核率。T-2毒素对小鼠具有胚胎毒性和致畸性，导致骨髓、内脏畸形和死胎。Corrier（1988）还通过实验发现，喂饲T-2毒素的小鼠肉瘤、艾氏腹水瘤和黑色素瘤的发生率均显著高于对照组。
关于单端孢霉烯族化合物造成的人类食物中毒，全世界已有不少报道。1931~1947年发生在前苏联的食物中毒可能与摄食被镰刀菌污染的谷物有关，中毒者的主要表现为口腔、食管和胃的慢性损伤，严重的白细胞缺乏、骨髓再生障碍等。研究者从食物中分离出了镰刀菌.1945~1963年日本和韩国发生的赤霉病谷物中毒，主要症状为恶心、呕吐、腹泻和腹痛。怀疑是由谷物中的禾谷镰刀菌引起。
单端孢霉烯族化合物引起的食物中毒现象已引起世界各国的重视。目前，加拿大、美国等国已制订了小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量标准。中国于1996年制订了小麦、玉米及其制品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量标准为：小麦、小麦面粉、玉米和玉米粉均≤1000μg/kg。
9.3.3 小麦中T-2毒素的酶联免疫（ELISA）吸附侧定 9.3.3.1主要仪器与材料
所有的玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡、用zolaishui、蒸馏水冲洗。酶标检测仪、酶标板（40孔或96孔）、具0.2ml尾管的10ml小浓缩瓶。 9.3.3.2 试剂
1.抗T-2毒素单克隆抗体与辣根过氧化氢酶结合物；
2.抗原 T-2毒素与载体蛋白-牛血清白蛋白的结合物（T-2-BSA ）； 3.ELISA缓冲液 包被缓冲液（pH9.6碳酸盐缓冲液）的制备：Na2CO3 1.59 g 、NaHCO3 2.93 g 加蒸馏水至1 000 ml。磷酸盐缓冲液（pH7.4 PBS）的制备： KH2PO4 0.2 g Na2HPO4·12H2O 2.9 g NaCl 8.0 g KCl 0.2 g 加蒸馏水至1 000 ml。
4.洗液（PBS-T）的制备 PBS加0.05%（V/V）吐温-20。 5.抗体稀释液的制备 BSA 1.0 g加PBS-T至1 000 ml。
6.底物缓冲液的制备 甲液（0.1 mol/L柠檬酸水溶液）：柠檬酸（C6H8O7·H2O）21.01 g，加蒸馏水于1 000 ml。乙液（0.2 mol/L磷酸氢二钠水溶液）：Na2HPO4·12H2O71.6 g，加蒸馏水至1 000 ml。用前按甲液+乙液+蒸馏水为24.3+25.7+50的比例（体积比）配制。
7.底物溶液 取50μLTMB（10mgTMB溶于1ml二甲基甲酰胺中）溶液+10ml底物缓冲液+10 μL30%H2O2，混匀。
8.T-2毒素标准溶液 用甲醇配置1mg/mlT-2毒素贮备液，-20℃冰箱贮存。于检测当天，粳米吸取贮备液，用20%甲醇的PBS（配制方法同PBS-T，不加土
温即可）稀释成制备标准曲线的所需浓度。 9.3.3.3 测定原理
将已知抗原吸附在固定载体表面，洗除未吸附的抗原，加入一定量的酶标记抗体与试样（含有抗原）提取液的混合液，竞争温育后，在固相载体表面形成抗原-抗体-酶复合物。洗涤多余部分，加入酶的底物。在酶的催化作用下，底物发生降解反应，产生有色物质，通过酶标检测仪，测出酶底物的降解量，从而推知被测试样中的抗原量。 9.3.3.4 分析步骤
1. 提取 样品粉碎后过20目筛，称取20.0 g，加入200 ml具塞锥形瓶中，加8ml水和100 ml三氯甲烷-无水乙醇（4+1），盖塞，振荡1h，用滤纸过滤，取25 ml滤液于蒸发皿中，置90℃水浴上通风挥干。用50 ml石油醚粉刺溶液蒸发皿中残渣，洗入250ml分液漏斗中，再用20ml甲醇-水（4+1）分次洗涤，转入同一分液漏斗，加盖振荡1.5min，静置约15min后，取下层甲醇-水提取液过层析柱净化（层析柱的装备：在层析柱下端与小管相连结处塞约0.1g脱脂棉，尽量塞紧，先装入0.5g中性氧化铝，敲平表面，再加入0.4g活性炭，敲紧）。
通过柱后的洗脱液 倒入蒸发皿中，并于水浴锅上浓缩至干，趁热加3ml乙酸乙酯，加热至沸，挥干，再重复一次，最后加3ml乙酸乙酯，冷至室温后转入浓缩瓶中。用适量乙酸乙酯洗涤蒸发皿，并入浓缩瓶中。将浓缩瓶置95℃水浴锅上，挥干冷却后，用含20%甲醇-PBS定容，供ELISA检测用。
2.用T-2-BSA（4μg/ml）包被酶标板，每孔100μL，4℃过夜。
3.酶标板用PBS-T洗3次，每次3min后，加入不同浓度的T-2标准溶液（制作标准曲线）或样品提取液（检测试样毒素含量）与抗体-酶结合物溶液（1+100）的混合液（1+1，每孔100μL，该混合应用于使用的前一天配好，4℃过夜），置37℃1.5h。
4.酶标板洗3次，每次3min后，加入底物溶液，每孔100μL，置37℃30min。 5.用1mol/L硫酸溶液终止反应，每孔50μL，于450nm波长处测定吸光度值。 9.3.3.5计算结果
V1X(ng/g)?c1?D? （9-5）
V2m式中：X——T-2浓度，ng/g；
c——酶标板上所测得的T-2毒素的量，ng，根据标准曲线求得； V1——试样提取液的体积，ml； V2——滴加样液的体积，ml；
D——样液的总稀释倍数； m——试样质量，g。 9.4 玉米赤霉烯酮
9.4.1 玉米赤霉烯酮的产生菌及其特点
玉米赤霉烯酮（Zearalenone ，ZEN），又称F-2毒素，是由镰刀菌产生的一种雌激素类真菌毒素。产生玉米赤霉烯酮最常见的是禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum，无性世代），此外还有三线镰刀菌（F.tritinctum）、串珠镰刀菌（F.moniliforem）、尖孢镰刀菌（F.oxysporum）、木贼镰刀菌（F.equiseti）等。禾谷镰刀菌在谷物上的生长繁殖最适温度为16~24℃，相对湿度为85%。该菌能在大麦、小麦、元麦上发生病变，也能在玉米、稻谷、蚕豆、甜菜叶上生长繁殖。 9.4.2 玉米赤霉烯酮的性质、来源、毒性及在食品中的限量标准 9.4.2 .1 玉米赤霉烯酮性质
纯的ZEN为白色晶体，分子式C18H22O5，分子量3l8，熔点161 ~163℃，不溶于水、二硫化碳、四氧化碳，溶于碱性溶液、乙醚、苯及甲醇、乙醇等，微溶于石油、醚等。其甲醇溶液在紫外光下呈明亮的绿一蓝色荧光。ZEN是一种取代的2，4一二羟基苯甲酸内酯，具有雌激素活性。结构见图9-4。
OHOOCH3HO图9-4 玉米赤霉烯酮的结构
9.4.2 .2 玉米赤霉烯酮的来源
O
它广泛存在于霉变的玉米、高梁、小麦等谷类作物和奶类品中，王若军等从华南、华北和华中的饲料厂、仓库及客户手中等采集的109个样品，使用酶联免疫法测定发现：在玉米饲料和全价料中玉米赤霉烯酮的检出率都高达到100％。在蛋白质饲料中玉米赤霉烯酮的检出率高达92.9％，而且超标严重。在被检饲料和饲料原料中，黄曲霉毒素并非主要的霉菌毒素，而ZEN的污染甚为严重。
9.4.2.3 玉米赤霉烯酮的毒性及在食品中的限量标准
ZEN具有很强的生殖毒性和致畸作用， Schweighardt（1980）认为lppm的低剂量就能导致猪和牛繁殖紊乱，Price et al（1993）认为50~100ppm的剂量就会影响到排卵、怀孕、胎儿发育、新生儿的存活率等。在l~l0nmol浓度时即能刺激雌激素受体的转录，还可以降低家畜的耗料量，导致生长下降，免疫抑制，繁殖障碍，给畜牧业带来很大的经济损失，现在已经成为养猪业的第二杀手。
对玉米赤霉烯酮的最高允许量标准，巴西规定玉米中不超过200μg/kg；罗马尼亚规定所有食品中不超过30μg/kg；前苏联规定谷物、油脂中不超过1000μg/kg。我国国标规定配合饲料、玉米不超过500μg/kg。 9.4.3 玉米赤霉烯酮的薄层色谱法测定 9.4.3.1 主要仪器与设备
薄层板涂布器、旋转蒸发器、慢速滤纸、展开槽、点样器、薄层色谱扫描仪（配有汞灯光源）。 9.4.3.2试剂与材料
1.展开剂:三氛甲烷一丙酮一苯一乙酸（18+2+8+1）。 2.显色剂:20g氯化铝（AlCl3·6H20）溶于100 ml乙醇中
3.薄层板:称取4g硅胶G，置于乳钵中加10 ml 0.5%羧甲基纤维素钠水溶液研磨至糊状。立即倒人薄层板涂布器内制备成10 cmX20 cm、厚度0.3mm的薄层板，在空气中干燥后，用甲醇预展薄层板至前沿，吹干，标记方向，在105℃~110℃活化1h，置于干燥器内保存备用。
4.ZEN标准储备溶液 称取适量的ZEN标准品，用甲醇配制成约100 μg/ml ZEN标准储备溶液。避光，于-5℃以下储存。标定储备液的浓度，用1 cm石英比色杯，以甲醇为参比，在ZEN的最大吸收峰波长314nm处，测定吸光度值A。储备液中ZEN的含量（X）以微克每毫升（1μg/ml）表示，按下式计算。
注意:凡接触ZEN的容器，需浸入4%次氯酸钠溶液，半天后清洗备用。为了安全，分析人员操作时要带上医用乳胶手套。
X1?式中:A- 测定的吸光度值；
A?M?100 （9-6）
???M- ZEN的摩尔质量（M=318 g/mol）；