第四章 药物定量分析与分析方法验证（一）
目的与要求
? 1、掌握不同结构药物的稳定性规律 ? 2、掌握色谱系统适用性试验的内容 ? 3、熟悉氧瓶燃烧法的实验过程
? 4、了解定量分析样品的前处理方法的进展及在药物分析中的应用
1、 掌握不同结构药物的稳定性规律
（1）与苯环直接相连，卤原子和苯环形成强共轭结构，电子云密度重新分布，此时卤原子结合牢固，不易脱离；需要破坏后才可分析。
（2）与脂肪链相连，结合不牢固；根据情况选择。
（3）与苄基相连，相当于活泼取代氢的位置，卤原子易脱掉，结合最不牢固，易处理。
2、掌握色谱系统适用性试验的内容 色谱的定量，都需要色谱系统符合一定要求，即要进行色谱系统适用性实验，包括对主要组分的理论塔板数、主要组分与其他组份的分离度，以及重复性和主要组分的峰对称因子（拖尾因子）等。其中分离度和重复性是其中更具实用意义的参数。 （1）、色谱柱的理论塔板数（n）：在规定的色谱条件下（固定相，流动相等），注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半高峰宽（Wh/2），按n＝5.54（tR/Wh/2）2计算色谱柱的理论板数，如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的效果等），使理论板数符合要求。
? 问：为什么不用峰宽来计算理论塔板数？ （2）、分离度（R）：无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。分离度的计算公式为： 式中tR2、tR1分别为相邻两峰中后一峰和前一峰的保留时间；W1及W2为此相邻两峰的峰宽。除另有规定外，分离度应大于1.5。 （3）、重复性：取各品种项下的对照溶液，连续进样3～5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别进样3次，计算平均校正因子。其相对标准偏差也应不大于2.0%。 （4）、拖尾因子（T）：为保证分离效果和测定精度，应检查待测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的规定。拖尾因子的计算公式为： 式中 W 0.05h 为 0.05 峰高处的峰宽； d 1 为峰顶点至峰前沿之间的距离。
? 除另有规定外，峰高法定量时T应在0.95～1.05之间。峰面积定量影响不大，也不应太大
3、熟悉氧瓶燃烧法的实验过程
氧瓶燃烧法：是将含有待测元素的有机药物置于充满氧气的密闭的燃烧瓶中充分燃烧，使得待测元素转化为不同价态的氧化物，被吸收于适当的吸收液中，然后根据待测物质的性质，选用合适的方法进行分析。
本法适用于分析含卤素有机药物、氮、硫和硒等药物。
操作法：在燃烧瓶中加入规定的吸收液，并将瓶口用水湿润；小心急速通氧气约1分钟（通气口接近液面），立即用表面皿覆盖瓶口，备用；点燃包有供试品的滤纸包，迅速放入燃烧瓶中，按紧瓶盖，用少量水封闭瓶口，使燃烧完毕，充分振摇，使生成的烟雾完全吸收入吸收液中，放置15min后，用少量水冲洗瓶塞及铂丝，合并洗液也吸收液。然后用同法做空白试验。 需要注意的问题：（1）氧气要充足！燃烧要充分。（2）瓶中不得有有机溶剂残留！（3）不得有润滑油等涂抹瓶口！ （4）水封瓶口，且用手按住瓶口！（5）选择合适的吸收液（多数是水和氢氧化钠的混合液）（6）若瓶中出现黑色颗粒，则为燃烧不充分。
4、了解定量分析样品的前处理方法的进展及在药物分析中的应用
药物的定量分析，需要根据分析方法的特点、药物的结构与性质，以及药物制剂的处方组成，采用合适的方法对样品进行处理，以满足所选择的分析方法对样品的要求。有些药物可以用相对较简单的方法处理，如化学药单体等；对于药物制剂来说，需要考虑处方中其他组分的干扰（在处理样品过程中除掉干扰，不同于色谱法的分离分析）
? 本节主要介绍含金属和卤素、硫、磷、硒等特殊元素的药物分析时的前处理过程。这些药物的处理方法需根据它
们在分子中结合的牢固程度不同而有所选择。
复习题
? 1、不同金属或卤素结合类型药物的稳定性？
（1）与苯环直接相连，卤原子和苯环形成强共轭结构，电子云密度重新分布，此时卤原子结合牢
固，不易脱离；需要破坏后才可分析。
（2）与脂肪链相连，结合不牢固；根据情况选择。
（3）与苄基相连，相当于活泼取代氢的位置，卤原子易脱掉，结合最不牢固，易处理。 含金属药物前处理有两种情况：
1）金属原子不直接与碳原子相连，通常为有机酸或者酚的金属配合物，即含金属的有机药物，结合不牢固，很容易在水溶液中离解成金属离子；如果有机结构部分不干扰分析，可在溶液中直接进行金属的鉴别和含量测定。
2）金属原子直接与碳原子以共价键连接，结合状态比较牢固，即有机金属药物。该类药物在溶液中一般不能解离成离子状态。此时，可以根据金属共价键的牢固程度，经处理后转变为可分析的离子状态，然后进行相应分析。
? 因此，对于含金属或卤素等的药物，需要根据药物与他们结合的牢固程度，预先进行适当处理。 处理方法：（1）不经有机破坏的方法，适用于与苄基相连的卤素及金属有机药物等；
（2）需要有机破坏的方法，适用于与苯环直接相连和有机金属药物等。
? 2、氧瓶燃烧法的注意事项？（见上页） ? 3、色谱法的主要特点？
色谱分析法是一种分离分析的方法，根据混合物中各组分的色谱行为差异，先行分离后在线对各组分逐一进行分析的方法，是分离混合物的有力手段
较常见的是TLC、HPLC、GC以及各种联用技术。定量一般用HPLC和GC等。 1、HPLC：适用范围广，越来越广泛； 2、GC：理论成熟，但使用受限；
3、TLC：少用于定量，TLCS应用不多 色谱分析法特点： 1）、条件选择范围宽，包括色谱柱、流动相、检测器等。 2）、应用范围宽：大部分药物都可以用色谱法分析，以HPLC为最广泛。3、灵敏度高，准确度好，重线性好。 4）、操作繁琐，实验消耗大。5、适用于多组分的分离分析，与光谱等联用，可进行定性和定量分析。
? 4、色谱系统适用性试验的主要内容？（见上页）
第四章 药物定量分析与分析方法验证（一）
目的和要求
? 1、掌握定量分析方法验证的主要内容； ? 2、熟悉生物药品前处理的主要方法； ? 3、了解生物样品的富集方法。
1、掌握定量分析方法验证的主要内容；
验证内容有：准确度；精密度（包括重复性、中间精密度和重现性）；专属性；检测限、定量限；线性、范围；耐用性等 一、准确度（Accuracy）
准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率(%)表示。准确度应在规定的“范围”内测试。“范围”指的是确定的测试方法适用的高低限浓度或量的区间。用于定量测定的分析方法均需做准确度验证。 （一）含量测定方法
1、原料药的测定：原料药可用已知纯度的对照品或供试品进行测定；或用本法测定供试品的结果与已知准确度的另一方法测定的结果进行比较。计算公式： 如果该分析方法已经测试，并求得其精密度、线性和专属性，在准确度可以推算出来的情况下，准确度可以不用再验证。
2、制剂的含量测定：主要测试制剂中其他组份及辅料对含量测定方法的影响。可用含已知量被测物的制剂各组分（包括制剂辅料）进行测定。计算公式同原料药的方法。如果不能获得制剂的全部组分，则可向制剂中加入已知量的被测物进行测定，回收率计算公式为： 中药分析回收率测定常采用此法，一般要求在95～105%之间。若 有些方法操作步骤繁多，可要求在90 ～110% 。RSD 一般在3% 以内。
制剂含量测定时要考虑辅料的影响，要尽量除去辅料的空白影响。制剂分析中，要求从自行制定的模拟样品开始，要求至少高、中、低三个浓度，每个浓度3份样品，共9个数据进行分析。一般仪器分析要求回收率的RSD为2%之内，而容量分析要可达到99.7～100.3%。对于生物样品分析，要求可以适当放宽
（二）杂质含量测定方法：多采用色谱法。回收率的测定可通过向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测试。 （三）数据要求：在规定范围内，至少用9个测定结果进行评价。
如设3个不同浓度，每个浓度分别制备3份供试品溶液进行测定。应报告已知加入量的回收率（%）计算值，或测定结果平均值与真实值之差及其相对标准偏差（RSD）或可信限。
二、精密度（Precision）系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。
精密度一般用偏差、标准偏差（SD）或相对标准偏差（RSD）表示。一般至少用6次结果进行评价精密度。精密度是考察分析方法在不同的时间、操作人员、实验室等所得结果的重现性和重复性。涉及含量测定的项目（含量测定和杂
S质定量）都需要验证精密度。 d?xi?xS???x?x?RSD??100%n?1x偏差（d）：测量值与平均值之差；标准（偏）差（SD或S）；相对标准（偏）差（RSD）
验证内容：精密度验证包括重复性、中间精密度和重现性 1、重复性:在较短时间间隔内，在相同操作条件下，由同一分析人员测定所得结果的精密度称为重复性，也称批内精密度。
2i测定时，可采用3个不同浓度，每个浓度3份供试品，共9个数据进行分析。也可以采用同一个浓度，用6个数据进行分析。
2、中间精密度：在同一实验室，由于实验室内部条件的改变，如不同时间、不同分析人员，用不同设备测定所得结果的精密度，称为中间精密度。 3、重现性:在不同实验室，由不同分析人员测定结果的精密度，称为重复性。重现性只有当方法被法定标准采纳时需要做。
三、专属性（Specificity）
专属性是指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在情况下，采用的方法能准确测定出被测物的特性。 能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力，也是用于复杂样品分析时相互干扰程度的度量。 鉴别反应、杂质检查、含量测定等均应考察专属性。如果方法的专属性不够好，需要采用多个方法进行补充。
（一）鉴别反应：应能与可能共存的物质或结构相似化合物区分。不含被测成分的供试品，以及结构相似或组分中的有关化合物，均应成负反应。
（二）含量测定和杂质测定：应用色谱法时，应附代表性图谱并应标明诸成分在图中的位置，以说明专属性，其中分离度应符合要求（>1.5）。
对于可获得杂质情况下，可通过加入杂质的方式，看杂质是否可得到有效分离。对于杂质不能获得的情况，可与其他已经验证的方法进行比较。必要时采用光二极管阵列检测和质谱检测，进行纯度检查。
四、检测限（Limit Of Detection，LOD）：检测限是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量。
反映了方法与仪器的灵敏度和噪音的大小，也表明样品经处理后空白值的高低。LOD是一种限度检查效能指标，无须准确定量，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。药品的鉴别试验和杂质检查方法均应验证LOD。 常用方法
1、目视法:用含已知浓度被测物的试样进行分析,目视确定能被可靠地检测出的被测物最低浓度或量。该法通常为仪器分析法中LOD的确定。 2、信噪比法:用已知浓度的样品信号与空白样品的信号进行比较。一般以信噪比S/N=3时确定LOD。 五、定量限（ limit of quantitation，LOQ）：
LOQ是指样品中被测物能被定量测定最低量，其测定结果应该具有一定的准确度和精密度。LOQ的方法与LOD相似，只是信噪比一般要大得多，其S/N=10。也 可用仪器所测空白背景响应标准差（SD）的10倍为估计值， 再经试验确定。
六、线性（Linearity）：线性系指在设计的“范围”内，测试结果（响应值）与样品中被测物浓度直接呈正比关系的程度。
应在规定的“范围”内测定线性关系。可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列供试样品的方法进行测定，至少制备5个浓度的样品。以测得的响应值作为Y，药物浓度为X，先作图；然后用最小二乘法进行线性回归分析。必要时，将响应值进行数字换算后再计算。
一般要求回归方程的相关系数越接近于1，表明线性关系越好。但对于生物样品来说，要求会低些。 数据要求：应列出回归方程、相关系数和线性图。 七、范围（Range）：范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。
范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果及要求确定。对范围也有不同要求：对原料药和制剂，范围为80～120%；制剂含量均匀度为70～130%，也可以根据剂型特点适当选择。如果规定了限度范围，一般为上限的+20%到下限的-20%。
首先给定浓度范围，即样品浓度（或质量）取值的最大和最小值，也是分析时样品浓度（质量）的上限和下限； 线性指的是在给定范围内样品测定信号与其浓度之间成正比的程度。一般以作图的方式或者回归方程的形式表示。线性与范围一般不分开。
八、耐用性（Robust）：
耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为使方法用于常规检验提供依据。
开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则应在方法中写明。指的是对于影响条件变化时的适应程度，应尽可能的宽松，有一定的缓冲能力。
典型的变动因素有：被测溶液的稳定性，样品提取次数、时间等。液相色谱法中典型的变动因素有：流动相的组成和pH值，不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱，柱温，流速等。经试验，应说明小的变动能否通过设计的系统适用性试验，以确保方法有效。
2、 熟悉生物药品前处理的主要方法；
生物样品的前处理非常重要，除少数情况下样品经简单处理后进行测定外，大部分情况下都需要对样品进行适当的处理，即进行分离、纯化和富集等，必要时还需要对待测组分进行衍生化处理，以满足分析目的和定量分析方法的各种要求。生物样品的前处理，需要考虑到如下方面：生物样品的种类；被测物的性质、存在形式和浓度范围；所采用的测定方法。
1、生物样品的种类：生物样品的种类不同，需要进行处理的过程也有差异。 血浆和血清需要去除蛋白质的干扰，使得药物才蛋白质结合物中释放出来；唾液样品相对简单，离心去除粘蛋白即可； 尿液常用酸或酶水解使得药物从缀合物中分离出来。
2、被测药物的结构和性质，以及存在形式和浓度范围等都对前处理有直接影响。
药物的酸碱性与溶解性涉及到药物的萃取手段；是否具有挥发性等可以考虑GC的分析；光谱特性和官能团性质涉及是否需要衍生化；浓度的高低也需要处理方法要求的高低等。 3、采用的测定方法不同，对于样品前处理的要求也不同。
HPLC方法对于去除蛋白是必须要求的；样品浓度的高低也决定去除蛋白的方法也不相同；GC对于是否需要制备衍生物有要求；光谱分析法则需要为纯物质，所以要求更高；放射免疫法的专属性很高，对于样品的处理也相对简单得多。 （一） 蛋白质的去除
目的：使得药物从结合型变成游离型，便于分析；减少后续处理过程中萃取时的乳化现象；保护仪器性能，避免造成损失，延长寿命。
常用方法：加入与水混溶的有机溶剂；加入中性盐；加入强酸；加入含锌盐或铜盐沉淀剂；酶解法。
1、加入与水相混溶的有机溶剂：有机溶剂的加入可以使得蛋白质分子内部及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，从而使得药物得以释放出来。
常用的有机溶剂有：乙腈、甲醇、丙酮和四氢呋喃等。常用的比例为：血浆/有机溶剂=1：1～1：3，可以去掉90%以上蛋白质。用乙腈做沉淀剂效果较甲醇更好些。而离心时的速度需要达到10000RPM及其以上。 2、 加入中性盐：加入中性盐，使得盐浓度增加，蛋白质脱水而沉淀。
常用的中性盐有：饱和硫酸铵、硫酸钠、镁盐、磷酸盐和枸橼酸钠等。常用比例为：血浆/饱和硫酸铵=1：2混合后，高速离心，可去除90%以上蛋白质。常与有机溶剂萃取法联用，以提高效率。
3、加入强酸：当溶液的pH低于蛋白质的等电点，蛋白质为阳离子状态，可与酸根阴离子结合而形成沉淀析出。
常用的强酸有10%的三氯乙酸（或三氟乙酸）等，比例为血浆/强酸=1:0.6混合，高速离心后，可去除90%以上蛋白质。 4、加入含锌盐及铜盐的沉淀剂:当pH高于蛋白质的等电点时,蛋白质分子中带负电荷的羧酸与金属阳离子形成不溶性沉淀 常用的沉淀剂有：CuSO4和ZnSO4等，混合的比例为血浆/沉淀剂=1：2，然后高速离心。
5、酶解法：在测定某些与蛋白质结合牢固、且对算不稳定的药物时，常加入一些酶而使得蛋白质分解，将药物释放出来。 常用的是枯草菌溶素。但也可以根据药物的不同选择合适的分解酶。该法操作简单，效果较好。但很多酶的价格很高，且不易获得是其缺点。
（二）缀合物的水解
?药物进入体内后，被免疫系统当作异物而代谢掉，其中一些含有羟基、羧基、氨基和巯基的药物，可与内源性的葡萄糖醛酸或葡萄糖酸酐等结合，形成极性大的无活性的缀合物。
?在测定尿液中药物的总量时，需要用适当的方法水解，然后再进行测定。其中酸水解法简便、快速，但专一性差、药物易分解；酶水解法专一性较强、药物无分解；但时间长、费用大，对于遇酸及受热不稳定的药物，可采用酶水解法。
（三）有机破坏
?生物样品中的金属原子常与蛋白质结合，难以用有机溶剂萃取，测定时多采取有机破坏的方法进行，如使用硝酸-高氯酸作为消解剂，将有机部分破坏掉，使得金属原子被转变成高价态的离子部分。
（四）分离、纯化和富集：样品的浓度高低对于前处理的影响很大。
如果样品浓度较高（ug/ml及其以上），所采用的方法灵敏度可达到要求，那么样品在简单处理（如沉淀蛋白或缀合物水解）后即可直接进行测定。在很多情况下，生物样品中药物的浓度很低（ng/ml及其以下），很多仪器条件（如UV检测）的灵敏度不够，此时需要将样品进行分离、纯化和富集，以达到分析的要求。
萃取法是应用最多的分离、纯化方法。目的是从大量样品中提取出所需要的微量组分，然后通过溶剂的蒸发而使得样品得到富集。萃取方法包括：液液萃取法——经典方法；液固萃取法——发展迅速方法。 1、 液液萃取法（Liquid-Liquid extraction，LLE）
适用于极性相对较小的药物，由于这些药物在有机溶剂中的溶解度（远远）大于在水相中的溶解度，而水相中的大多数内源性物质极性较大，根据相似相溶原理，可以用有机溶剂将小极性药物从水相中萃取出来，同时可以除去大部分的干扰物质，包括大量蛋白质等。该方法是传统方法，仍在大量使用。
LLE需要考虑有机溶剂的特性、有机溶剂相和水相的体积，以及水相的pH值等。所选用的有机溶剂，要求对被测组分的溶解度大（能提取完全），沸点低（易于蒸发或挥发除去），与水不相混溶（容易分离）、无毒（苯类溶剂不要用）、化学稳定（不易燃、不爆炸）、不易乳化（影响萃取效果）等。最常用的是乙醚和三氯甲烷（先难以购买，可用二氯甲烷替代）。所用的有机溶剂要适量，一般有机相与水相（液体样品）的容积比为1：1或2：1，也可根据实际情况进行确定。 如果有机溶剂体积过大，后续的挥发时间较长；体积过小，则可能提取不完全，影响测定结果的准确性。
溶液的pH值对与LLE的影响非常大。多数药物是亲脂性的碱性药物，内源性物质多为酸性，所以在碱性条件下提取药物，可以使得药物呈原型状态而被易于提取出来，而内源性物质则留在水相中。可用适当碱性溶液（如碳酸氢钠-氢氧化钠的混合液作为碱化试剂）一般情况下，有机溶剂的萃取只萃取一次。
LLE的优点是选择性好，操作简单，成本低。大多数的药物都可以与内源性物质得以分离，对结果的干扰较小。但该法不适合于极性大的药物的分离和纯化。
2、液固萃取法（LSE）
液固萃取法（Liquid-Solid extraction，LSE）是近年来发展非常迅速的方法，主要采用柱色谱分离方法，将具有吸附、分配和离子交换性质的固定相作成萃取小柱，将生物样品通过此小柱，可以用适当溶剂将干扰物洗脱掉，将药物保留在固定相上，再用适当的溶剂洗脱下来进行分析。
LSE的特点：引入杂质较少，样品洗脱后可直接分析；消除在LLE中常见的乳化现象；萃取效率高，可用少量样品进行分析；最后洗脱多为以水为主的溶剂，安全性高；样品处理速度快，对挥发性和热不稳定性药物更合适； 缺点是价格高，有时重复性差。
3、被测组分的富集
样品的萃取是一个去除杂质的纯化过程，但因为此时有机溶剂的体积较大导致药物的浓度较低，一般情况下不能直接用于分析。还需要进一步的富集。富集的方法一般为：最后一次萃取的溶剂为小体积，使得药物的浓度可达到分析方法的灵敏度；或者将有机溶剂挥发，然后再用小体积的合适的溶剂（如流动相）复溶解后再分析。
挥去萃取溶剂的常用方法是直接通入高纯氮气流吹干有机溶剂，药物保留在试管底部。因为氮气的性质不活泼，对于保护药物不分解有帮助。如果药物本身稳定，也可以通入干净的空气流，以减少成本。对于遇气流挥发或者遇热不稳定的药物，可以用减压法挥去溶剂（真空干燥箱），此法可同时处理多个样品。溶剂蒸发时最好采用尖底玻璃试管，可使得少量溶剂富集在底部，便于吸取。
（五）化学衍生化
?衍生化方法曾是定量分析的主要方法之一，特别是在GC中，该法可使得许多不易气化的成分变成GC可测定的物质。 ?在HPLC中，衍生化的目的多是提高药物的灵敏度，如给氨基酸药物加上荧光基团，可以用荧光检测器分析等。 ?衍生化有柱前衍生化和柱后衍生化等，前者较常用，后者干扰少，选择性高。
3、了解生物样品的富集方法。
富集的方法一般为：最后一次萃取的溶剂为小体积，使得药物的浓度可达到分析方法的灵敏度；或者将有机溶剂挥发，然后再用小体积的合适的溶剂（如流动相）复溶解后再分析。
挥去萃取溶剂的常用方法是直接通入高纯氮气流吹干有机溶剂，药物保留在试管底部。因为氮气的性质不活泼，对于保护药物不分解有帮助。如果药物本身稳定，也可以通入干净的空气流，以减少成本。对于遇气流挥发或者遇热不稳定的药物，可以用减压法挥去溶剂（真空干燥箱），此法可同时处理多个样品。
溶剂蒸发时最好采用尖底玻璃试管，可使得少量溶剂富集在底部，便于吸取。