方法学验证的选择复习题： ? 1、定量分析方法学验证主要包括哪些内容？（见上页） 精密度鉴别试验：杂质限度检查：杂质含量测定：原料药主要成分含量测定：制剂中主要成分含量测定：?准确度检测限定量限专属性???????线性范围耐用性??????????????????溶出度和药物释放度：?生物样品含量测定：???????????2、生物样品分析的方法学验证有哪些特点？ 生物样品与一般样品相比，具有取样量少、药物浓度低、大量内源性物质干扰，以及个体差异较大等特点，因此为了保证方法的可靠性，有必要对生物样品采取更为严谨的定量分析方法，并对方法进行验证。 29与前边的方法学验证内容相比，生物样品定量分析方法验证的内容在如下几方面特点： （一）特异性：由于内源性物质干扰较多，所以特异性成为生物样品分析的重点。主要是证明测定的物质确为要分析的成分，而其他物质的存在对其分析不构成干扰。
色谱法的特异性主要证明材料包括：不同来源的空白生物样品色谱图（空白）； 空白样品外加标准物质色谱图（空白+标准）；用药后的真实生物样品色谱图（样品）。
（二）标准曲线与线性范围：在生物样品标准曲线中，除样品点数量最低不少于5个外，空白的本底值也要求尽可能小，表现为截距要尽可能的接近0。回归方程的相关系数r≥0.990。常采用的回归分析法为加权最小二乘法，该法对于低浓度较大偏差的影响有一定降低。标准曲线最低浓度点的回归值与标示值的误差在±20%以内，而其余点在±15%以内。 （三）精密度和准确度：要求选择高、中、低3个浓度的质控样品进行精密度和准确度的验证。要求低浓度点应接近定量下限，高浓度接近定量上限，每个浓度至少5个样品。要有批内精密度和批间精密度的计算。要求低浓度点的精密度应小于20%，其他点不高于15%。批间精密度要求3天连续制备并测定。准确度要求在85～115%之间，最低浓度点在80～120%之间。
（四）定量下限：定量下限是标准曲线上的最低点，在生物等效性分析中要求能测定3～5个半衰期药物浓度，或Cmax的1/10~1/20时的浓度。其精密度和准确度都要符合相应的要求。
（五）样品的稳定性：根据具体情况，对生物样品需要在室温、冰冻和冻融（反复冻融）条件下，以及不同存放时间进行稳定性考察，以确定生物样品的存放条件和时间。还应考察储备液的稳定性以及样品处理后的稳定性等。 ?要求准确度85%～115%，RSD＜15%。
（六）提取回收率 生物样品的预处理方法：——重点考虑方法准确度(或相对回收率)，操作简便、快速；
——萃取回收率(绝对回收率，absolute recovery)，≥70%
萃取回收率与相对回收率的意义不同：萃取回收率——考察生物样品预处理过程造成的药物的程度损失；
相对回收率——采用标准曲线可准确计算生物样品中药物浓度
（七）质控样品：质控样品是将已知量的待测物加入到生物基质中配制的样品，用于精密度和准确度的质量控制。 一般情况下，需要配制3个浓度的质控样品，每个浓度大约2个样品左右。在分析时将质控样品相对均匀的分散到样品中去，以监控分析方法的稳定性和准确性。
? 3、样品的分离和纯化有哪些方法？
萃取法是应用最多的分离、纯化方法。目的是从大量样品中提取出所需要的微量组分，然后通过溶剂的蒸发而使得样品得到富集。萃取方法包括：液液萃取法——经典方法；液固萃取法——发展迅速方法。 1、 液液萃取法（Liquid-Liquid extraction，LLE）
适用于极性相对较小的药物，由于这些药物在有机溶剂中的溶解度（远远）大于在水相中的溶解度，而水相中的大多数内源性物质极性较大，根据相似相溶原理，可以用有机溶剂将小极性药物从水相中萃取出来，同时可以除去大部分的干扰物质，包括大量蛋白质等。该方法是传统方法，仍在大量使用。
LLE需要考虑有机溶剂的特性、有机溶剂相和水相的体积，以及水相的pH值等。所选用的有机溶剂，要求对被测
组分的溶解度大（能提取完全），沸点低（易于蒸发或挥发除去），与水不相混溶（容易分离）、无毒（苯类溶剂不要用）、化学稳定（不易燃、不爆炸）、不易乳化（影响萃取效果）等。最常用的是乙醚和三氯甲烷（先难以购买，可用二氯甲烷替代）。所用的有机溶剂要适量，一般有机相与水相（液体样品）的容积比为1：1或2：1，也可根据实际情况进行确定。 如果有机溶剂体积过大，后续的挥发时间较长；体积过小，则可能提取不完全，影响测定结果的准确性。
溶液的pH值对与LLE的影响非常大。多数药物是亲脂性的碱性药物，内源性物质多为酸性，所以在碱性条件下提取药物，可以使得药物呈原型状态而被易于提取出来，而内源性物质则留在水相中。可用适当碱性溶液（如碳酸氢钠-氢氧化钠的混合液作为碱化试剂）一般情况下，有机溶剂的萃取只萃取一次。
LLE的优点是选择性好，操作简单，成本低。大多数的药物都可以与内源性物质得以分离，对结果的干扰较小。但该法不适合于极性大的药物的分离和纯化。 2、液固萃取法（LSE）
液固萃取法（Liquid-Solid extraction，LSE）是近年来发展非常迅速的方法，主要采用柱色谱分离方法，将具有吸附、分配和离子交换性质的固定相作成萃取小柱，将生物样品通过此小柱，可以用适当溶剂将干扰物洗脱掉，将药物保留在固定相上，再用适当的溶剂洗脱下来进行分析。
LSE的特点：引入杂质较少，样品洗脱后可直接分析；消除在LLE中常见的乳化现象；萃取效率高，可用少量样品进行分析；最后洗脱多为以水为主的溶剂，安全性高；样品处理速度快，对挥发性和热不稳定性药物更合适； 缺点是价格高，有时重复性差。
? 4、各种生物样品的特点？
生物样品的种类不同，需要进行处理的过程也有差异。 血浆和血清需要去除蛋白质的干扰，使得药物才蛋白质结合物中释放出来；唾液样品相对简单，离心去除粘蛋白即可； 尿液常用酸或酶水解使得药物从缀合物中分离出来。 一、常用样品的种类、采集和贮藏
生物样品包括各种体液和组织，最常见的是血液样品，其次是唾液和尿液，在做组织分布时组织样品也很常用。
（一）血样（Blood）血样包括血浆、血清和全血。血药浓度主要指血浆或血清中的药物浓度，而不是全血中的药物浓度。
一般认为，当药物在体内达到稳态平衡时，血浆中的药物浓度能够反映药物在体内靶器官的浓度（但可反映多
少呢？），因而常把血浆药物浓度作为体内药物浓度的测定指标。
血样的采集：对于患者来说，通常采用静脉取血方式；对于动物来说，可以采用更灵活的方式，如静脉、动脉、心脏等。一般不能取太多 ?血样的制备：
（1） 全血：取全血后，加入凝血剂（肝素、枸橼酸钠等）防止凝结，不进行离心操作。
（2） 血浆（Plasma）的制备：将加了抗凝剂的全血混匀后，以2500～3000RPM离心5～10min，使得血浆与血细胞分
离，其中的淡黄色上清液即为血浆。
（3） 血清（Serum）的制备：将采集的血样在室温下放置0.5～1hr，带血液凝固后，用玻璃棒轻轻剥离雪饼，然后以2000～3000RPM离心5～10min，分取上层的淡黄色液体即为血清。
血浆与血清相比，它们的药物浓度测定值基本相同，但是血浆分离的比较快，而且制取的量约为全血的50%~60%（血清只为全血的20%~40%），多数研究者用血浆进行分析测定。若血浆中含有的抗凝剂对药物浓度测定有影响时，则应使用血清样品。
血样主要用于药物动力学、生物利用度等研究及临床治疗药物浓度监测等需要知道相对确切药物浓度的分析中。 血样采取后，应及时分离血浆和血清，否则血细胞破裂而发生溶血，导致药物与各种蛋白等结合，致使无法测定。 如果可以，最好及时分析血样。若不能立即测定，需要放置试管中密塞保存。短期（一周内）可放在冰箱中保存（4度左右），长期保存需在-20或-80度冷等保存。全血不宜低温冷冻保存。 （二）唾液
唾液的分泌量相对较大，而且其获取较血液容易得多，而且有些药物的唾液浓度与血浆浓度密切相关，所以有时也采用唾液进行测定。唾液的采集应在安静状态下，漱口15min后采集。采集后去掉泡沫部分，然后在3000RPM离心10min，取上清液使用。唾液采集后，应在4度以下保存。在解冻时，需要充分搅匀后使用，避免浓度不均匀。 （三）尿液
药物的清除主要通过尿液排出。尿液中可存在药物的原形、代谢物和缀合物等，浓度高，量大，采集方便。但尿液中药物浓度变化较大。所以，其应用的目的与血样有区别，主要在药物剂量回收、肾清除率、生物利用度以及药物代谢等方面的研究。尿的主要成分是水、尿素和各种盐类等。不宜长期放置，而且需要加入防腐剂保存。
尿液浓度与血浆浓度没有明显的相关性。受到肾功能的影响比较大。一般收集采用自然排尿的方式，包括时尿、晨尿等几种形式。测量每次收集的尿液体积，分别或集中收集（集中收集应测量总体积），加防腐剂后保存。