(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 2.消毒和灭菌的区别 条 件 消毒 较为温和的物理或化学方法 灭菌 强烈的理化因素 结 果 杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物 杀死物体内外所有微生物 能否消灭芽孢和孢子 常用方法 不能 煮沸消毒法；巴氏消毒法；化学药剂消毒法等 能 3.常见消毒灭菌方法比较 方 法 消 毒 化学药物消毒法 紫外线消毒法 灭 干热灭菌法 菌 高压蒸汽灭菌法 电热鼓风干燥箱160～170℃加热1～2h 100kPa、121℃维持15～30min 灼烧灭菌法 煮沸消毒法 巴氏消毒法 操作过程 100℃煮沸5～6min 应用范围 日常生活中广泛使用 高压蒸汽灭菌法；干热灭菌法；灼烧灭菌法 60～80℃下处理15～30min 牛奶、啤酒、果酒和果酱等不宜进行高温消毒的液体 用体积分数为70～75%的乙醇、碘酒涂抹，来速水喷洒等 30W紫外灯照射30min 酒精灯火焰灼烧 用于皮肤、伤口、动植物组织表面消毒，空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等 接种室空气 微生物接种工具如接种环、接种针或其它金属用具等，接种过程中试管口活锥形瓶瓶口等 玻璃器皿（如吸管、培养皿等）、金属用具等凡是不适宜用其他方法灭菌而又能耐高温的物品。 培养基及多种器材、物品 4. 无菌操作原理：针对不同对象采用不同的消毒和灭菌的方法，在高温、高压、化学药剂、强酸和强碱作用下，使微生物蛋白质凝固变性，从而达到杀菌的目的。本实验采用酒精对实验者双手消毒，紫外线对操作环境照射消毒，对培养基采用高压蒸汽灭菌，对玻璃器皿进行干热灭菌和接种环灼烧灭菌等。
四、实验操作（微生物培养、分离、计数和鉴定比较） （一）大肠杆菌纯化培养
1.培养基配制原理：微生物生长繁殖时需要各种营养物质，一般包括水、无机盐、碳源和氮源，有的还需要少量特殊营养物质（生长因子）。根据微生物的种类和实验目的不同，选择不同的原料配制不同培养基，配后要及时灭菌。本课题使用牛肉膏蛋白胨培养基，它是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基，也称普通培养基。它含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl，其中牛肉膏为细菌提供碳源和能源，磷酸盐；蛋白胨主要提供氮源；而NaCl提供无机盐。
在配制固体培养基时还要加入琼脂作凝固剂。在培养细菌时要用稀酸或稀碱将pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。 实验流程：1. 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 计算→称量→溶化→灭菌→倒平板
培养配制微生物培养基时注意事项：（1）溶化琼脂时要控制火力的大小并不断搅拌，以免培养基溢出或烧焦；（2）加热过程中部分水分蒸发，待琼脂完全溶化后应补加蒸馏水，以保持溶液的浓度；（3）分装至试管时培养基的高度不要超过试管高度的1/5；（4）一般是培养基先灭菌再倒平板，也可先倒平板,课间再灭菌；（5）冷却后的平板要倒置，以确保拿放方便，同时避免水分蒸发，以利微生物生长。
2. 纯化大肠杆菌的原理：为了获得大肠杆菌的纯培养，选用平板划线法或稀释涂布平板法，在牛肉膏蛋白胨培养基上操作，在培养基上将大肠杆菌稀释或分散成单个细胞，经培养后可分离得到由单个细胞繁殖而来的子细胞群，即菌落。这个菌落就是一个纯化的细菌菌落，这样就达到分离纯化的目的。 ? 划线接种的基本步骤和说明 序列 1 2 3 4 5 6 操作步骤 将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红 在火焰旁冷却接种环，拔除盛有菌液的试管棉塞 将试管口通过火焰 分析说明 将接种环灭菌，避免污染菌种 避免杂菌污染菌种 7 8 灼烧灭菌，防止试管口菌体污染培养基 将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取菌液 冷却接种环可避免杀死菌种 将试管口通过火焰，并塞上棉塞 避免试管口杂菌污染菌种 左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌初步接种。划破培养基不利于后续的种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条继续划线，长出的菌落不标准 平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基 灼烧接种环，冷却后从第一区划线的末端从上个区域的末端向下个区域划线,向第二区划线。重复以上操作，在第三、可逐步分离出单个菌体，从而实现微四、五区划线。注意不要将最后一区的划生物的纯化 线与第一区相连 将平板倒置，放入培养箱中培养 倒置平板防止水分蒸发，也方便拿放 平板划线操作和稀释涂布平板操作注意事项：
划线操作时注意：（1）用接种环取菌种之前、每次划线之前和划线结束都要进行灼烧灭菌，
灼烧后要在酒精灯附近冷却后再操作；（2）划线时不要划破培养基，如果采用分段划线法操作从第二次操作应总在上一次划线末端开始，首尾区不能相连；（3）操作必须始终在酒精灯火焰旁进行。
涂布操作时注意：（1）配制系列梯度稀释液时，所用的试管和移液管均需灭菌，必须用无菌水配制；（2）涂布器用70%的酒精消毒，多余酒精在烧杯中滴尽，沾有少量酒精的涂布
器在酒精灯火焰引燃。不要将过热的涂布器放入盛有酒精的烧杯中，以免引燃其中的酒精；（3）配制系列梯度稀释液和转移菌液以及涂布过程等必须都在酒精灯火焰旁进行，移液管头不能接触任何物体。
（二）土样中分解尿素的细菌的分离与计数
1.分解尿素细菌的筛选原理：能合成脲酶的细菌才能分解尿素。配制以尿素为惟一氮源的培养基，能够生长的细菌就是能分解尿素的细菌。 2.统计菌落数目原理：
（1）直接计数法：这种方法是指利用特定的细菌计数板或者血细胞计数板，在显微镜下计
2?
算一定容积样品中微生物的数量。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个面积为1 mm和高0.1 mm的计数室，该计数室又均分成400个小格。测量时将稀释的样品滴加在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下数出每个小格所含的细菌的平均数，再按下面的公式求出每毫升样品所含的细菌数。
每毫升原液所含的细菌数＝每小格平均细菌数×400×1 000×稀释倍数（此方法的缺点是分不清活菌和死菌。） 2.间接计数法?
稀释涂布平板法，常用来统计样品中的活菌数，当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。计算公式：每克样品中的菌落数=（某稀释度下平板上生长的平均菌落数c÷涂布平板时所用的稀释液的体积v）×稀释倍数M.。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是如果稀释的倍数不够大，很可能出现两个或者更多的细菌在一起共同形成一个菌落的情况，在最后计算时，我们却是按照一个细菌来计算的。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。
实验流程：土壤取样→配制土壤溶液和制备培养基→系列稀释→涂布平板与培养→菌落计数 注意事项：整个过程中要注意无菌操作，一定要建立“有菌观念”，知道杂菌无处不在。对不同的器具要选择不同的灭菌方法。 （三）分解纤维素微生物的分离
刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理:刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红－纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌
实验流程：土壤取样→选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落
注意事项：培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落：对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。
分离的结果是否一致：由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，学生也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。
微生物的培养 复习题
1．（西城一模，4）组氨酸缺陷型沙门氏菌是由野生菌种突变形成的，自身不能合成组氨酸。将其接种在缺乏组氨酸的平板培养基上进行培养，有极少量菌落形成。2-氨基芴是一种致突变剂，将沾有2-氨基芴的滤纸片放到上述平板培养基中，再接种组氨酸缺陷型沙门氏菌进行培养，会有较多菌落出现。以下叙述不正确的是 ．．．
A．在接种前，2-氨基芴和滤纸片须进行灭菌处理 B．若用划线法接种可以根据菌落数计算活菌数量 C．基因突变的可逆性与是否存在致突变剂无关 D．此方法可以用于检测环境中的化学致突变剂 2．（昌平一模，4）以下研究方法或手段不能达到目的的是 ．．A．用32P标记DNA的噬菌体侵染细菌，证明DNA是遗传物质 B．用平板划线法和稀释涂布平板法均可获得单菌落 C．用光学显微镜观察叶绿体的双层膜结构
D．通过家系调查来分析某种遗传病的遗传方式
3.（东城一模，31）（16分）β-葡萄糖苷酶是微生物细胞分泌的一种纤维素酶，可催化纤维二糖水解为葡萄糖。已知在β-葡萄糖苷酶的催化下七叶苷分解产生的七叶素可与柠檬酸高铁铵反应形成黑色化合物，该反应在培养基中产生的黑色圈可用来鉴定菌种。研究人员欲从土样中分离筛选出产β-葡萄糖苷酶的菌株，并对该酶的特性进行相关的实验研究。 请分析并回答：
（1）富集与筛选：将适量土样放入液体培养基中，37℃摇床震荡培养。为获得单菌落，可将上述菌液经 后接种到固体培养基上。要想鉴定筛选的菌株，需在培养基中额外添加 。实验结果如下表：
菌种 结果 产酶时间（h） 黑色圈直径大小（cm） 颜色 菌种1 2.5 1.00 + + + 菌种2 菌种3 菌种4 菌种5 菌种6 5 0.90 + + 5.5 0.75 + + 2 1.10 + + + 2.5 0.75 + + + 5 0.80 + 注：“+”的多少代表颜色的深浅
由表中结果分析，菌种 为最适菌种，理由是 。
（2）酶学特性研究：
①酶液的粗提取：将筛选出的菌种进行培养，培养液中的酵母膏和蛋白胨可为菌种提 供 。培养一段时间后，要从培养液中分离得到β-葡萄糖苷酶，可采用 的方法对培养液进行处理，得到的 即为粗提取的酶液。
②测定酶的酸碱稳定性：β-葡萄糖苷酶催化的化学反应速率可以通过测定 来表示。不同pH缓冲液中加入粗酶液后，在最适温度下保温1小时后测得实验结果如下：
分析可知，pH范围在 时，酶的pH稳定性达80%以上，比较酸性和碱性环境对该酶的影响可知，此酶对 环境耐受性较差。
4.（石景山一模，29）（15分）恒化器是微生物连续培养时使用的大型容器，容器中一部分
旧的培养基以一定的速度流出，同时不断有等量的新鲜培养基流入以保证微生物对营养物质的需要。研究人员将大肠杆菌JA122菌株接种到葡萄糖含量受到限制的培养基中，在恒化器内连续培养773代，然后取样分析其中存在的新菌株。请回答下列问题： （1）用于连续培养JA122大肠杆菌的培养基属于 。培养基中除了含
葡萄糖作为 _________外，还应该含有 。 （2）样品中共发现CV101、CV103、CV116三种新菌株，产生新菌株的原因是由于JA122
大肠杆菌发生了 导致的，产生三种不同类型的新菌株说明 。
（3）下图表示将CV101、CV103、CV116三种新菌株混合在一起培养的生长情况，三者之
间互为 _________关系，并保持稳定生长水平，没有出现一个菌株生存而另外两种菌株灭绝的现象，说明它们已经具有了不同的适应能力，这是 的结果。
（4）对三种菌株的代谢差异进行分析发现，CV103对葡萄糖吸收率最高，代谢终产物是醋