6. 试述一般培养基的配制方法和操作步骤。高压蒸汽灭菌和干热灭菌的操作方法怎样？应注意哪些事项？ 答：一般培养基的配制方法如下 (各种天然培养基的配制方法略有不同): l. 按照配方的组分及用量先分别称量并配成液体；2. 根据要求调到一定的酸碱度(pH值)；3. 若要制成固体则加入2%琼脂并加热融化；4. 根据需要的数量分装入试管或三角瓶中, 加上棉塞或盖上纱布； 5. 包扎好灭菌后备用。
配制斜面培养基为例，一般操作步骤为：称量 → 溶解 → 调pH值 → 加琼脂 → 过滤 → 分装 → 加棉塞 → 包扎 → 灭菌 → 摆斜面 → 无菌检查。
高压蒸汽灭菌法 一般培养基、无菌水、耐热药物及玻璃器皿等常采用高压蒸汽灭菌法。该法的优点是时间短, 灭菌效果好。它可以杀灭所有的微生物, 包括最耐热的细菌芽孢及其它休眠体。
一般培养基常用0.1MPa (1 kg/cm2或15 Ib/in2 ), 约120℃维持15～20分钟, 便可达到彻底灭菌的目的；单独玻璃器皿灭菌的温度可高些, 维持的时间可长些。灭菌的温度及维持的时间, 应随灭菌物品的性质和容量多少而灵活掌握。
要注意灭菌的因素是高温而不是高压, 故灭菌锅内的冷空气要彻底排除 (在排除冷空气的条件下, 蒸汽压与温度之间有一定关系)，否则, 压力虽达到0.1Mpa (l kg/cm2 ), 但温度并没有达到要求。
干热灭菌法 常用玻璃器皿(培养皿、三角烧瓶、试管、吸管等)、金属器皿及其它干燥耐热物品, 烘干后经适当包扎(勿装液体), 可采用干热灭菌法。干热灭菌一般在电烘箱内利用干热空气灭菌。
该法比湿热灭菌法所需的温度要高些 (160～170℃), 时间也要长些 (1～2 h)。但灭菌温度若超过180℃, 包扎器皿的纸或棉塞就容易烧焦。
7. 为什么微生物菌种移接的所有操作, 均应在无菌环境下进行严格的无菌操作？ 什么是无菌的环境条件？ 什么是无菌操作技术？
答：微生物无处不在, 无孔不入, 因此, 在对微生物的研究和应用过程中, 必须随时注意保持微生物纯培养物的纯洁性, 防止乃至杀灭其他微生物(杂菌)的混入；在进行分离、转接及培养微生物纯培养物时, 要采用严格的无菌操作技术, 防止被其他微生物所污染。
在微生物学研究中, 常需用接种环把微生物纯培养物, 由一个器皿移接到另一个培养容器中进行培养。由于周围环境(主要是空气)中, 存在着大量肉眼无法发现的各种微生物, 只要一打开器皿，就可能会引起器皿内的培养基或培养物, 被环境中其他微生物所污染。此外，实验室人员与所试验的微生物，应保证没有或最少直接接触或气雾接触。因此, 微生物菌种移接的所有操作, 均应在无菌环境下进行严格的无菌操作。
无菌环境是指在无菌室、无菌箱、超净工作室或超净工作台等无菌或相对无菌的环境条件下进行操作。 无菌操作技术的要点是要充分利用酒精灯焰周围的高温区(无菌区), 即接种时, 管口和瓶口始终保持在火焰 (如酒精灯焰)旁边, 进行熟练的移接种操作, 以便保证微生物的纯种培养。此外，挑取和移接微生物纯培养物用的接种环及接种针, 应采用易于迅速加热和冷却的镍铬合金等金属制备, 使用时用火焰灼烧灭菌；转移液体纯培养物时, 应采用无菌吸管或无菌移液枪。
8.常用的微生物分离纯化方法有哪些？ 这些方法各有什么优缺点？
答：常用的微生物分离纯化方法有：稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法、平板划线分离法、稀释摇管法、液体培养基分离法、单细胞分离法、选择培养分离法等。其中前三种方法最为常用,不需要特殊的仪器设备, 分离纯化效果好
稀释混合倒平板法有两个缺点，一是会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间,缺乏溶氧而生长受影响,形成的菌落微小难于挑取；一是在倾入熔化琼脂培养基时，若温度控制过高,易烫死某些热敏感菌，过低则会引起琼脂太快凝固, 不能充分混匀。
在微生物学研究中, 更常用的纯种分离方法是稀释涂布平板法。另一种简单快速有效的涂布平板法, 为玻璃涂棒连续涂布分离法。
平板划线分离法的特点是简便快速, 但单个菌落并不一定是由单个细胞形成的，需再重复划线1～2次, 并结合显微镜检测个体形态特征, 才可获得真正的纯培养物。
9. 厌氧微生物常用哪些纯培养技术？ 简述厌氧手套箱培养法的原理和操作过程。
答：目前, 已发展了很多厌氧微生物培养技术, 有化学方法、物理方法、物理与化学相结合的方法，如真空干燥器化学吸氧法、厌氧罐培养法、厌氧手套箱培养法、厌氧发生袋培养法、庖肉培养基法、亨盖特氏(Hungate)厌氧技术等。
厌氧手套箱是利用通入的氢气, 在箱内黑色钯粒的催化下, 与氧结合生成水的反应, 达到除去箱内氧的目的。厌氧箱可分为操作室和交换室两部分。
操作室用于进行厌氧操作, 前面有一对供操作用的套袖及胶皮手套。操作室内的常温钯粒和干燥剂用钢丝网分别装着, 并与电风扇组装在一起, 不断除去操作室内的氧及所形成的水分。操作室内还备有接种针和用于接种针灭菌的电热器, 有的还安装有培养箱。
交换室是用于室外物品的放入和室内物品的取出。交换室又与真空泵及混合气钢瓶相连。混合气体体积分数一般为10 % CO2 、5 %～10 % H2和80 %～85 %高纯N2 。
以平板法分离双歧杆菌的纯培养为例, 厌氧手套箱的操作过程：厌氧箱的准备 → 培养物的准备 → 换混合气培养 → 观察挑取菌落。
10. 微生物菌种长期保藏根据什么基本原理？ 常用哪些保藏菌种的方法？ 这些方法各有什么优缺点？ 答：微生物菌种保藏共同的基本原理是：使微生物的新陈代谢处于最低或几乎停止的状态, 因而极少或不发生变异；保藏方法通常都是基于温度、水分、氧气、营养成分和渗透压等方面考虑；保藏条件都是人工方法创造的低温、干燥、缺氧环境。
目前，已建立了许多种长期保藏菌种的方法, 包括：斜面冰箱保藏法、穿刺法、液体石蜡保藏法、沙土管保藏法、滤纸法、甘油低温保藏法、冷冻干燥保藏法、低温法、液氮超低温保藏法等。
斜面冰箱保藏法操作简单、使用方便, 但保藏时间短、容易被污染；液体石蜡保藏法制作简单, 不需经常移种, 实用且效果较好； 沙土管保藏法操作通常比较简单, 效果较好, 可保存几年时间, 广泛应用于抗生素工业的生产菌种保藏中, 但不能用于保藏营养细胞；甘油低温保藏法简单易行，保藏时间可达1年至几年；冷冻干燥保藏法综合利用了各种有利于菌种保藏的因素（低温、干燥和缺氧等），是目前最有效的菌种保藏方法之一； 液氮超低温保藏法比其他任何保藏方法都要优越, 被世界公认为防止菌种退化的最有效方法, 适用于各种微生物菌种的保藏。
11. 了解并熟悉不同工业微生物的生理与发酵试验技术有什么实用意义？ 如何进行微生物对碳源和氮源的利用试验？ 厌氧的酵母菌酒精发酵试验与好氧的短杆菌谷氨酸发酵试验有什么不同？
答：了解不同工业微生物的生理特性, 并熟悉其生理与发酵试验技术。使人们能利用这些不同的生理特性, 作为不同微生物分类鉴定和菌种选育的依据；利用它们的多种发酵类型和代谢产物, 更有效地为发酵工业作贡献。
碳源的利用试验：(1) 糖类发酵试验 绝大多数细菌和酵母菌都能利用糖类作为碳源和能源,但它们在分解糖类物质的能力上有很大差异，糖类发酵试验主要是试验多种糖类能否被利用作为碳源或能源。 (2) 淀粉水解试验 淀粉酶能水解淀粉成为小分子的糊精、双糖和单糖, 此过程可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。淀粉遇碘液会产生蓝色反应, 但细菌水解淀粉后的周围区域, 用碘测定不再显示蓝色, 使平板上的菌落周围出现透
明圈, 表明该细菌能产生淀粉酶, 以此鉴别不同细菌。(3) 脂肪水解试验 脂肪也是碳源之一。 微生物对大分子的脂肪不能直接利用, 必须依赖其胞外产生的脂肪酶, 将脂肪分解成小分子的甘油和脂肪酸, 才能被微生物所吸收利用。脂肪被脂肪酶水解后产生的脂肪酸, 可改变培养基的pH.，使pH降低。加入培养基的中性红指示剂, 会使培养基从淡红色变为深红色, 说明微生物胞外能产生脂肪酶。
氮源的利用试验：工业微生物对于氮源的利用, 主要是看其对蛋白质、蛋白胨、氨基酸、铵盐和硝酸盐的利用能力, 例如：(1)酵母菌对氮源利用试验； (2)明胶液化试验；(3)石蕊牛奶试验；(4)尿素分解试验；(5)硝酸盐还原试验。
酒精发酵试验是在无氧条件下, 某些酵母菌(如酿酒酵母)能把己糖转化为酒精和二氧化碳的作用, 称为酒精发酵。酵母菌由于其种类不同, 酒精发酵力的强弱也不同, 工业生产上必须采用酒精发酵过程中所生成的二氧化碳和酒精的量, 以及计算其发酵度来测定不同酵母菌种的发酵力。
谷氨酸发酵试验是在有氧条件下,谷氨酸短杆菌在各种酶系的作用下, 葡萄糖经己糖酵解、单磷酸己糖、三羧酸循环和乙醛酸循环等途径生物合成谷氨酸。因此，谷氨酸发酵是好氧性发酵。谷氨酸短杆菌是生物素营养缺陷型，当培养基中含有充足的生物素时，菌体大量生长，但不积累谷氨酸产物，因此，发酵培养基中的生物素要控制在一个亚适量的水平 (除非采用特殊的发酵工艺)。
12. 在科研和工业发酵生产实践中，最常用的微生物检测项目主要有哪些？ 各有什么实际意义？试举例说明之。
答：在科研工作和生产实践中，最常用的微生物检测项目是细胞数或生长量的测定。例如， 在酒精、啤酒和白酒等的成熟酒母在镜检时, 除了要求菌体细胞饱满肥大、细胞质均匀、空泡小、出芽率高外, 还要求酵母细胞数每毫升达到l亿个以上, 以此作为酵母菌繁殖能力和培养成熟的指标；又例如，在谷氨酸发酵生产中，每间隔2～4 h，就要取样用光电比浊法测定发酵液的光密度(OD)，以此作为短杆菌增殖数量的指标, 有助于指导发酵过程的工艺控制。
13. 简述水和食品中细菌菌落总数的测定程序。 多管发酵法测定水与食品中大肠菌群数的操作过程有何异同？
答：细菌菌落总数是指水或食品检样经处理, 在肉汁营养琼脂培养基中, 于37℃经24 h培养后, l ml或l g检样中所生长的嗜中温需氧性细菌菌落总数。一般都采用平板菌落计数法进行测定。它主要作为判定水和食品被污染程度的标志, 也可应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态, 以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。
水和食品中细菌菌落总数的测定与前面的平板菌落计数法测定活菌数, 在原理和方法上基本是相同的。其测定过程如下：培养基的制备 → 检样的采取 → 检样的稀释 → 倾注平板及培养 → 菌落总数的计算 → 菌落总数的报告。
食品中大肠菌群数是以每100毫升(克)检样中大肠菌群最可能数(MPN)表示的。多管发酵法检测食品中大肠菌群数的操作过程为：培养基的制备 → 食品检样稀释 → 乳糖初发酵试验 → 平板分离培养 → 证实试验 → 报告MPN。
14. 噬菌体的检查根据什么原理？ 试述单层琼脂平板法检查噬菌体和双层琼脂平板法测定噬菌体效价的方法及操作过程。
答：噬菌体侵染敏感寄主细胞后, 释放出子代噬菌体, 通过琼脂再扩散到周围的细胞中, 继续侵染引起更多细胞裂解, 从而在平板上形成一个个肉眼可见的透亮无菌近圆形的空斑, 称为噬菌斑, 它是噬菌体存在的一种特性标志, 由此检出噬菌体的存在。
单层琼脂法 将指示菌液和经适当稀释的噬检液与单层培养基一起倾注平板。充分混匀并凝固后，置适温下培养约12 h，观察计数。此法较简便，可用于噬菌体的效价测定。但若培养基较厚易产生上下噬菌斑重叠现象，影响计数的准确性。
双层琼脂法 一般采用的效价测定方法。 双层琼脂法是先用含2％琼脂的固体培养基倾注底层平板，再在其上倾注一薄层半固体上层培养基，上层培养基事先已与对数期指示菌液和噬检液混合均匀。经适温培养后，便可观察计数。
此法的优点是所形成的全部噬菌斑基本处于同一平面上，因而各斑大小均匀，边缘清晰易见，不发生上下噬菌斑重叠现象。此外，因上层半固体培养基较稀，使形成的噬菌斑较大，也有利于计数。因此，该法是一种被普遍采用并能精确测定效价的方法。
单层琼脂法噬检操作过程
双层琼脂法测定噬菌体效价操作过程
第五章 微生物的代谢调节与控制
1. 什么叫生物氧化？微生物的生物氧化有哪3种方式？各有什么特点？
答：生物氧化 (biological oxidation) 就是发生在活细胞内的一系列产能性氧化反应的总和。生物氧化不同于普通的氧化反应。首先，它们是由一系列酶在温和的条件下按一定次序催化的多步式梯级反应；第二，生物氧化反应放能是分段逐级进行的；第三，生物氧化反应中释出的能量一部分以化学能的形式储藏在ATP分子等能量载体内。
根据微生物进行生物氧化时有无外界的最终电子受体，可以把微生物生物氧化分为呼吸和发酵两大类。没有
任何外源的最终电子受体的生物氧化类型称为发酵，有外源的最终电子受体的生物氧化类型称为呼吸。再根据外源最终电子受体是不是分子氧，又可以把呼吸分为有氧呼吸和无氧呼吸。
有氧呼吸是一种最普遍又最重要的生物氧化或产能方式，其特点是底物脱下的氢经完整的呼吸链传递，最终被外源分子氧接受，产生了水并释放出ATP形式的能量。这是一种递氢和受氢都必须在有氧条件下完成的生物氧化作用，是一种高效产能方式。
无氧呼吸指一类呼吸链末端的氢受体为O2以外的外源氧化物。这是一类在无氧条件下进行的、产能效率较低的特殊呼吸。其特点是底物脱氢后，经部分呼吸链递氢，最终由氧化态的无机物或有机物受氢，并完成氧化磷酸化产能反应。
发酵是指在无氧等外源氢受体的条件下，底物脱氢后所产生的还原力[H]未经呼吸链传递而直接交某一内源中间代谢物接受，以实现底物水平磷酸化产能的一类生物氧化反应。其特点是以有机化合物作为电子供体（被氧化）和电子受体（被还原），电子的传递不经过细胞色素等中间电子递体，直接由电子供体交给电子受体，因此可以看作是分子内的转移。这种氧化作用不彻底，最终形成还原性产物，只放出一部分化学能，而大部分能量仍储存在还原性产物中。
2. 试述异氧微生物对糖降解途径的多样性及其生理机能。
答：工业上使用的微生物绝大多数属化能异氧型，以糖类作为最重要和最普遍的碳源和能源。糖类作为氧化基质，通过各种降解方式形成构建菌体成分的中间代谢物，同时伴以能量的产生。微生物降解葡萄糖的方式很多，远比高等生物复杂，其降解途径及最终产物因微生物种类和发酵条件而异，主要有下列方式： （1）EMP途径
EMP途径是多种微生物所具有的代谢途径，其产能效率虽低，但生理功能极其重要：①供应ATP形式的能量和NADH2形式的还原力，厌氧微生物是以此途径作为获得能量的唯一方式；②是连接其它几个重要代谢途径的桥梁，包括三羧酸循环（TCA）、HMP途径和ED途径等；③为生物合成提供多种中间代谢物；④通过逆向反应可进行多糖合成。若从EMP途径与人类生产实践的关系来看，则它与乙醇、乳酸、甘油、丙酮和丁醇等的发酵生产关系密切。 （2）HMP途径
HMP途径在微生物生命活动中意义重大，主要有：
①供应5-磷酸核糖，以合成嘌呤和嘧啶核苷酸，最后合成核酸、辅酶等；
＋＋
②提供大量的还原力NADPH＋H，除了部分被转氢酶催化变为NADH＋H，再进入呼吸链氧化，可生成大量的ATP外，主要还是作为细胞合成脂肪酸、胆固醇、谷氨酸等需氢的一种重要来源；
③途径中的4-磷酸赤藓糖是合成芳香族氨基酸的前体；
④磷酸戊糖循环的功能对于光能和化能自养菌具有重要作用，这两类微生物细胞中的含碳成分都是由CO2
和1,5-二磷酸核酮糖缩合而成，而后者是由5-磷酸核糖转变而来；
⑤生成的6-磷酸果糖、3-磷酸甘油醛等可进入EMP途径，进而代谢为丙酮酸，这样HMP途径与EMP途径相联系。 （3）ED途径
ED途径是少数EMP途径不完整的细菌所特有的利用葡萄糖的替代途径。由于它可与EMP途径、HMP途径和TCA循环等代谢途径相联，故可相互协调，满足微生物对能量、还原力和不同中间代谢产物的需要。所以ED途径也是微生物的一条重要代谢途径，广泛分布在细菌尤其是革兰氏阴性菌中。 （4）PK途径
除了常见的EMP途径、HMP途径和ED途径外，尚有两个磷酸酮缩酶途径（phosphoketolase pathway，简称PK途径）是少数细菌所有的，例如异型乳酸发酵的乳酸杆菌、双叉乳杆菌和双歧杆菌等，因为该途径的部分与HMP途径相同，所以可认为是HMP途径的分叉。
3. 何谓组成酶、诱导酶？诱导酶是如何被诱导合成的？ 答：微生物体内参与代谢活动的酶，有些是细胞所固有的，经常存在于细胞内，以恒定速度和恒定数量生成，不随微生物的代谢状态而变化，这一类酶称为组成酶（constitutive enzymes）；而另一些酶，在一般情况下细胞内不生成或数量很少，这些酶只有在底物或其结构类似物存在时才生成，这一类酶被称为诱导酶（induced enzymes），引起酶生成的化合物叫诱导物。
酶的诱导可以用Jacob和Monod提出的操纵子模型（Operon Model）来解释，例如大肠杆菌乳糖操纵子包括三个结构基因z、y、a（相应编码β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷透性酶和β-半乳糖苷转乙酰酶）和结构基因前面的操纵基因（O）和启动子（P），这三种酶都能被乳糖或β-半乳糖苷系列化合物所诱导。其作用机制是：当不