嘌呤对IMP合成途径的关键酶PRPP转酰胺酶有阻遏作用，因此发酵过程中对于IMP的积累有一个最适浓度，腺嘌呤过量的时候IMP积累受到抑制，菌株生长增加。 补救合成途径也是产氨短杆菌积累IMP的重要途径。在补救合成途径中，核苷酸焦磷酸化酶受嘌呤核苷酸的反馈抑制，由于核苷酸渗透出细胞比较困难，故此在解除反馈抑制的前提下，必须考虑细胞膜的渗透性。锰离子与细胞膜渗透性就有着密切的关系。锰离子限量时，细胞膜产生异常，并会引起细胞形态发生变化，造成细胞伸长或者膨胀，成不规则形状，同时由于细胞渗透性的变化，很多核苷酸补救合成途径的酶系分泌出来，在胞外经补救合成积累IMP，从头合成途径形成的IMP也分泌出细胞外，解除相应的反馈调节机制，使得细胞内的IMP生物合成持续进行，总的效果都是在胞外积累IMP。如果锰离子过量则IMP产量锐减，转换成次黄嘌呤发酵。
生产菌株的选育：一般应该选择核苷酸酶和磷酸酯酶活性较弱的菌株作为育种的出发菌株。常见的肌苷酸生产菌株有枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、产氨短杆菌等。常用的产氨短杆菌、谷氨酸棒杆菌等菌株的磷酸酯酶活性极低。而枯草杆菌的核苷酸分解酶系活力比较强，生成的核苷酸容易被酶分解为核苷，所以一般采用诱变后
W
核苷酸分解酶微弱(Nt)的突变株作为出发菌株。
----- 解除IMP合成途径的反馈调节，可以采用以下几种突变株：①选育Ade、Ade＋Xan或者Ade＋Gu突变株；
LLL-Linsr
②选育Ade、Ade＋Xan或者Xan、Ade＋Mn等突变株；③选育抗类似物突变株，如8-AG（8-氮鸟嘌呤抗性株）、
rr-W
6-MG（6-巯基鸟嘌呤抗性株）、8-AX（8-氮黄嘌呤抗性株）等；④以枯草芽孢杆菌为出发菌株，选育Ade＋Nt、-VW
Ade＋Nt突变株。
2＋2＋ins
解决细胞膜渗透性问题可以通过限量添加Mn或者选育Mn不敏感突变株(Mn)，或者核苷酸膜透过性强的突变株。也可以通过选择抗生素、表面活性剂等调节细胞膜渗透性。 发酵条件的控制：目前生产上一般普遍采用的都是缺陷型菌株，因此在其培养基的组成上需要满足一定的条件。日本有学者利用产氨短杆菌的腺嘌呤缺陷型KY7208菌株进行IMP发酵合成，对该菌株的培养基组成进行了详细的研究。培养基中除了需要添加一定量的腺嘌呤外还有很多其他方面的特殊要求。其结果表明：①添加高浓度(各1％左右)的磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，同时相应添加高浓度硫酸镁，将有利于菌株生长及积累IMP；②添加高浓度磷酸盐、镁盐的时候，锰离子、硫胺素以及泛酸钙对菌株的生长和IMP积累是必须的；③在突出高磷、高镁的培养基中，加入某些氨基酸如组氨酸、赖氨酸、高丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸等的混合物可以促进菌株生长和IMP的积累；④对积累IMP来说，锰、锌、亚铁以及钙等金属离子是菌株必须的，尤其是锰离子的影响显著，必须亚适量控制。
在IMP发酵过程中还应该考虑到温度的影响。在较高温度下，补救合成途径的酶系能够被激活，而残留的微弱IMP分解酶系被钝化，从而能比低温培养过程积累更多的IMP。最适温度的选择需要同时考虑菌株生长和IMP积累的要求。可以采用分段控制温度来优化整个过程。
培养基中需要添加一定量的玉米浆等富含生物素的组分。IMP仅在生物素充分、腺嘌呤适量的时候才大量积累。锰离子的亚适量控制对于大规模发酵过程来说比较困难，因为发酵过程中采用的工业原料以及工业用水都含有较高的锰离子。对此有两种解决方法：①在发酵期间添加某些抗生素或者表面活性剂，解除过量锰离子的影响。有报道指出添加链霉素、环丝氨酸、丝裂霉素C以及青霉素等抗生素，或者聚氧化乙烯硬脂酰胺、羟乙基咪唑等
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表面活性剂，对积累IMP是有效的。②另一种方法是选育对锰离子有抗性的突变株，即Mn突变株，使得IMP积累不会受到过量锰离子的影响。
第十一章 微生物与现代生物制药
1. 世界上第一个有效抗菌物质—青霉素是怎样发现的？
答：在英国细菌学家弗莱明（Fleming）发现了点青霉能产生一种活性抗菌成分并命名为青霉素（Penicillin）的10年后，牛津大学病理学教授Florey和他的助手Chain组织了20多位不同学科的学者进行攻关。经过一年多时间的努力，首次制得青霉素结晶并在1941年应用于临床试验，奠定了青霉素的治疗学基础。1942年，美国Merck制药公司在Florey和Chain的帮助下，开始工业化生产青霉素并大规模用于临床试验，为挽救在第二次世界大战中战伤受细菌感染而濒临死亡的伤员生命, 发挥了奇特的决定性的重大作用。
1943年又发现产黄青霉菌（P．chrysogenum）, 经选育后表现出更高的青霉素产生能力，使青霉素的产量大大提高。同年，Chain又确定了青霉素的分子结构。至此，第一个利用微生物发酵制备抗生素的工业化获得了成功，开创了抗生素黄金时代的到来，被誉为二次大战中三大发现之一，而Fleming、Florey和Chain三位科学家同时获得了1945年度诺贝尔医学生理学奖。
2. 请说出下面这些主要天然抗生素的产生菌：青霉素、头孢菌素C、链霉素、庆大霉素、红霉素、四环素、螺旋霉素。
答：青霉素 产黄青霉 ( Pencillnum chrysogenum )、头孢菌素C 顶孢头孢子菌（Cephalosporium acremonium） 、链霉素 灰色链霉菌（S．griseus）、庆大霉素 棘孢小单孢菌 ( M．echinospora )、红霉素 红色链霉菌（S．erythreus）、四环素 金霉素链霉菌（S．aureofaciens）、螺旋霉素 生二素链霉菌（S．ambofaciens）。
3. 筛选新抗生素产生菌常用哪些方法？ 微生物法测定抗生素生物效价常用哪些方法？
答：新抗生素产生菌的常用筛选方法有下列几种：琼脂块移置法、培养液扩散法、抗肿瘤抗生素的筛选法、抗病毒抗生素的筛选法。
微生物检定法测定抗生素生物效价，一般可分为稀释法、比较法和琼脂扩散法。以琼脂扩散法（亦称管碟法）应用最广泛。该法的一般操作步骤是：先将固体培养基融化并倒制平板，待凝固后，在上面再倒一层混有试验菌的融化培养基。凝固后，在表面放置不锈钢管子，向管子中加入抗生素稀释液，适温培养一定时间。经培养后，由于抗生素向培养基中扩散，凡抑菌浓度所达之处，试验菌不能生长而呈透明抑菌圈。量取抑菌圈直径并进行效价计算。
4. 什么是半合成抗生素？ 简述半合成法制新青霉素的步骤和半合成头孢菌素的酶促 生产方法。
答：通过酶法或化学法修饰原抗生素的化学结构，改进天然抗生素的性能，包括克服耐药性、增强抗菌活性、扩展抗菌谱、改善药代动力学性能、降低毒副反应、增强稳定性以及适应制剂要求等诸方面，从而创制出具有新特点的抗生素。
半合成法制新青霉素的步骤为： ① 由微生物发酵法获得青霉素G或V；② 采用酶法水解青霉素G或V制备青霉素6–APA母核；③ 采用酶法将酰基侧链联结到6–APA母核上。
半合成头孢菌素的酶促生产方法：
① 7–ADCA母核的制取 用化学扩环法可以将青霉素G或V转变为头孢菌素（五环扩展为六环），且酰化酶更易催化此类头孢菌素水解。水解产物为青霉素G或V的侧链产物苯乙酸或苯氯乙酸和母核7–氨基–3–去乙酰氧基－头孢菌素(简称7–ADCA）。 一般采用固定化酰化酶法进行水解反应，其过程大致为：培养巨大芽孢杆菌 ?提取酰化酶 ? 次乙酰塑料或硅藻土吸附酶 ? 洗涤、装填柱式反应器 ? 底物上柱反应 ? 收集流出液 ? 制取7–ADCA母核。
② 半合成头孢菌素的酶促合成 以?-氨基苯乙酸甲酯酰基化到7–ADCA母核上，合成头孢氨苄（即先锋霉素Ⅳ号）为例：将色素杆菌变种或巨大芽孢杆菌或大肠杆菌的活细胞与DEAE纤维素结合并吸附于羟基磷灰石上，也可将活细胞包埋于三醋酸纤维素中实现固定化，反应底物与固定化细胞进行酶促合成反应，从而制得头孢氨苄（先锋Ⅳ号）。
5. 采用微生物发酵法和酶法可生产哪些生物药物？
答：微生物发酵法和酶法可生产药用氨基酸、核苷酸类药物、维生素类药物、辅酶类药物、药用酶等。
6. 用微生物发酵法进行生产的药用酶类有哪些？
答：用微生物发酵法进行生产的药用酶类有：L－天冬酰胺酶（L-asparaginase）、链激酶（streptokinase, SK）、弹性蛋白酶（elastase）、β－半乳糖苷酶 （β－galactoridase）等。
7. 微生物转化合成甾体药物一般可分为哪两个阶段进行？ 答：微生物转化甾体一般可分为两个阶段进行：
(1) 菌体生长期 为了获得较多的酶，首先保证菌体的充分生长，一方面供给菌体以丰富的营养，使其充分繁殖与发育，另一方面依不同菌种的要求选择最适的培养条件。
(2) 甾体的转化反应 在微生物菌体生长的适当时间（一般为中后期）逐渐将待转化的
甾体基质（溶于有机溶剂或粉末）加到微生物的悬液中。基质加入的反应方式有：由生长培养进行反应；由静态菌体悬浮进行反应；由固定化酶或固定化菌体进行反应；混合培养进行反应等。对于必须采用两种微生物进行的转化反应，可用同一培养基将两菌种进行混合培养，再先后进行两种转化反应。
8. 利用微生物及其代谢产物制备的各种预防类生物制品主要有哪些？ 请简述一般菌苗和疫苗的制备过程。 答：利用微生物及其代谢产物制备的各种预防类生物制品有：
(1) 疫苗 由立克次氏体和病毒制成，包括减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗。 (2) 菌苗 由有关细菌、螺旋体制成，包括减毒活菌苗、死菌菌苗、 纯化菌苗。 (3) 类毒素 由有关细菌产生的外毒素经脱毒后制成。 (4) 混合制剂 由两种以上疫苗或菌苗或类毒素混合制成。
菌苗的制备过程包括：菌种的选择 、 培养条件的控制 、 死菌苗的制备 、 稀释分装和冻干。 疫苗的一般制备过程如下：毒种的选择和减毒、病毒的繁殖、疫苗的灭活、疫苗的纯化、疫苗的冻干。
9. 从微生物次级代谢产物中寻找各种生理活性物质可生产哪些新型微生物药物？
答：从微生物次级代谢产物中寻找各种生理活性物质生产的新微生物药物有：酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂等。
10.已商品化的以微生物为表达系统的基因工程药物主要有哪些？它们有何生理功能及 临床用途？
答：已商品化的以微生物为表达系统的基因工程药物主要有：人胰岛素、人生长激素、干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、红细胞生成素、肿瘤坏死因子、组织型纤溶酶原激活剂、人心钠素、乙型肝炎疫苗等。
11.基因工程药物无性繁殖系的构建过程通常包括哪些步骤？
答：基因工程药物无性繁殖系的构建过程通常包括：① 基因工程药物目的基因的制取；② 目的基因与克隆载体的体外重组；③ 重组克隆载体引入宿主细胞的转化与转导（感染）；④ 含目的基因重组体的筛选、鉴定与分析，⑤ 目的基因在宿主细胞中的高效表达。