不同的判断原则。如利用相关系数(CS)来评价不同菌株的基因型之间的关系。即CS=两个细菌间相同的基因带数×2/两个细菌的基因带数的总和。CS<0.85时为不同型,0.86≤CS<0.99时为相关,但是,两个细菌的基因带数相差3条以上也为不同型。此外还有应用不同的计算机分析软件进行结果判断的。BioNumerics(Version 4.0)数据库软件进行处理,识别图像条带。聚类图类型选择UPGMA (Unweighted Pair group Method using Arithmetic averages)方法,条带位置差异容许度选择1.0%,优化值选择0.5%。
六 PFGE的影响因素 PFGE受很多因素的影响:
1 缓冲液的种类、浓度和温度的影响
缓冲液中的离子浓度越低,电泳跑得越快。Buffer缓冲液的温度影响整个电泳时间和结果,缓冲液的温度越低,电泳跑的越慢,得到的条带越细直,结果越理想。目前认为14℃能得到最好的电泳带型。
2 电泳时脉冲角度的重要性
使用较小的角度,如106°来改善染色体DNA 的分离状况;使用较小的角度,可以把电泳时间减少50%;随着角度的减小,较大的片段分离的更好,更理想,较小的片段分离的效果降低。因此要根据分离片段大小来调整脉冲角度。
3 电泳时脉冲时间的重要性
脉冲时间就是电极在单一方向改变所需要的时间,如30s的脉冲时间即为电极在单一方向受脉冲作用30s,然后在另一个方向作用30s。为了得到理想的PFGE图像.脉冲时间是最重要的参数。为了分离小片段的样本,通常减小脉冲时间;为了分离大片段的样本,通常增大脉冲时间。
4 电泳过程中电压梯度的影响
电压梯度反映电场的强度(V/cm),大多数CHEF协议认为:对于850 kb左右的DNA片段,6 V/cm的电压梯度最适宜;处理大于3 Mb的DNA时,使用1.5~3 V/cm,以及一个较小的电泳角度;处理小于250 kb的DNA时,使用9 V/cm,以及一个较小的电泳角度;调整脉冲时间以达到理想的电泳效果。
七 PFGE方法的局限和不足
1 耗时。随着PFGE方法的不断完善,部分菌属周期长的缺点已逐渐为一种快速PFGE方法(24~48 h)所克服。
2 电泳带型易受人为等多种因素的影响,故需要较高的技术水平。
3 并不是对所有情况都适合。Brain等认为,PFGE有时不能区分同一地区一段时间内的散发病例。这可能是由于这些病例来源于同一菌株的原因。
4 不能同时优化胶的每个部分的条带分布。 5 结果得到的是条带,而不是序列。
6 不能确切地认为相同大小的条带就是相同的DNA片段。
泳动距离相同的片段并不总是具有同源性的基因。因此,脉冲场凝胶电
泳分析对于大小相似的片段分辨率不是很高。
7 不同条带之间并不是无关的、相互独立的,而是互相联系的。 8 一个酶切位点的变化可能引起不止一个条带的变化。
9 PFGE得到的亲缘关系只能起到一个指导作用,而不是真正意义上的种系发生量度。暴发可能由同种细菌的多个亚型引起,因此仅仅PFGE图谱的差异不能说明菌株不是来自共同的传染源。流行病学结论应该结合流行病学调查结果和其他分子分型资料才能最终确定疾病的传染源。
10 有些菌种用PFGE是不可分的。C.Foucault等发现对于有广泛基因重组现象的细菌,PFGE并不是一个适宜的分子分型工具。
尽管如此,PFGE分型技术在大肠杆菌O157:H7等细菌的分子生物学分析中还是得到了广泛的应用,也是目前最推崇的方法之一。在近几年里,许多实验室采用此方法进行流行病学分析,显示了其强大的功能和可应用性。