生化笔记
求甘氨酸等电点
? 将Ka1和Ka2相乘，得： ? Ka1Ka2=[H+]2[A-]/[A+]
? ? ? ?
甘氨酸酸性强于乙酸
甘氨酸中与羧基相邻的α-NH3+ 基是一个强吸引电子的基团，产生一个强场效应而稳定羧基阴离子；
α-COO-基的存在影响α-NH3+ 的解离，甘氨酸的α-氨基的碱基明显低于乙胺。
氨基酸的解离常数可用测定滴定曲线的实验方法求得。
标准氢氧化钠溶液进行滴定，以加入的氢氧化钠的摩尔数对pH作图，则得滴定曲线B段，在pH9.60处有一个拐点。
从甘氨酸的解离公式(2), Ka2=[A-][H+]/[A0]可知，当滴定至甘氨酸的兼性离子有一半变成阴离子，即[A0]=[A-]时，则Ka2=[H+]，两边各取负对数得pKa2=pH，这就是曲线B段拐点处的pH 9.60。
如果用标准盐酸滴定，以加入的盐酸的摩尔数对pH作图，则得滴定曲线A段，在Ph2.34处有一个拐点。
从解离公式(1) Ka1=[A0][H+]/[A+] ，当滴定至甘氨酸的兼性离子有一半变成阳离子，即[A0]=[A+] 时，则Ka1=[H+]，两边各取负对数得pKa1=pH，这就是曲线B段拐点处的pH 2.34 。
等电点时，[A+]=[A-],因此：
[H]2= Ka1Ka2，两边取负对数，得 pI = (pKa1+pKa2) /2
甘氨酸等电点= (2.34+9.60)/2=5.97
氨基酸滴定
? 向氨基酸例如甘氨酸溶液中加入过量的甲醛，用标准氢氧化钠滴定时，由于甲醛与
氨基酸中的一NH2作用形成一NH·CH20H，一N(CH20H)2等羟甲基衍生物，而降低了氨基的碱性，滴定终点也移到pH 9附近。亦即酚酞指示剂的变色区域。
总结
? 先解离α-COOH,随后其他-COOH； ? 再解离α-NH3+ ,随后其他-NH3+ ； ? 羧基解离度大于氨基
? 脂肪酸的-COOH基pKa值一般4-5，脂肪胺中-NH3+基pKa值一般10-11 ? 二元酸（侧链不解离的中性氨基酸）： ? 三元酸（酸性和碱性氨基酸） ： R基不解离的氨基酸都具有类似甘氨酸
R侧链基团不解离的氨基酸 PI=（PK1+PK2）/2 （一氨基一羧基的氨基酸）
一氨基二羧基的氨基酸 PI=（PK1+PKR）/2 二氨基一羧基的氨基酸 PI=（PK2+PKR）/2
? 找到净电荷为零的兼性离子，将其两侧的pK求和除2即为等电点。
? 对于三级以上的电离平衡，远处的pK值与兼性离子两侧的pK值相比差别较小时，
不再适用。
1.在pH10的谷氨酸溶液中，下列哪一种结构占优势？ E A.羧基氨基都解离 B.羧基氨基都不解离 C.只α-羧基解离 D.只γ-羧基解离
E.α-羧基和γ-羧基都解离
2. 氨基酸等电点时，主要以（ ）离子形式存在，在pH大于pI的溶液中，大部分以（ ）离子形式存在，在pH小于pI的溶液中，大部分以（ ）离子形式存在。 两性 阴 阳
如何计算多肽的等电点和电荷情况（不同pH情况下）？
测试题：
某氨基酸溶液中，有四种氨基酸A、B、C、D，其等电点分别为10、4、7、5，如不考虑次要因素，
1）采用阳离子交换柱并用盐浓度或pH梯度进行洗脱，将按何种顺序被洗脱？ 2）采用阴离子交换柱并用盐浓度或pH梯度进行洗脱，将按何种顺序被洗脱？ 3)你能用什么办法将它们分离开 答案：
1、最先流出B—D—C—A 2、最先流出A—C—D—B
蛋白质迁移取决于它的大小和形状
? 变性电泳：在电泳缓冲液、凝胶中含有十二烷基磺酸钠(SDS)；上样缓冲液中含有SDS
和二硫键还原剂 (如巯基乙醇，二硫苏糖醇[DTT]), 电泳前样品加热煮沸一般约5分钟。该电泳英文缩写：SDS-PAGE 变性电泳特点 ? （1） SDS能够与蛋白质结合，导致蛋白质变性。不同蛋白质-SDS复合物形状相似，
都呈椭圆状；
? （2）大量SDS的负电荷使不同蛋白质本身所带电荷忽略不计，蛋白分子越大结合
的SDS越多，各蛋白质-SDS复合物的电荷密度（ρ）趋于一致；
? （3）蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率取决于蛋白质（亚基）分子量的大小。
? SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，
使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
蛋白质测序策略
? 酸解测定氨基酸含量 ? 拆分蛋白质成多肽链(N/C) ? 断开链内二硫键
? 裂解多肽链成小的片段 ? 测定各肽段氨基酸顺序
? Edman化学降解法（Edman，1950，FITC） ? 酶降解法：末端附件很少几个残基 ? 质谱法：电喷射电离串联质谱法
?