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确定二硫键位置
确定二硫键位置一般选用胃蛋白酶水解，因为它的专一性比较低，切点多，生成的肽段包括含有二硫桥的肽段比较小，对于后面的分离鉴定比较容易。其次胃蛋白酶作用pH在酸性范围（大约2），有利于二硫键发生交换反应造成的麻烦。对角线电 泳分离进行分离，把水解后的混合肽段点到滤纸中央，在ph6.5下进行第一向电泳，肽段将按照大小及电荷的不同分离开，然后滤纸暴露在过甲酸蒸汽中，是s-s断裂，每个含二硫键的肽段被氧化成一对含磺基丙氨酸的肽。滤纸旋转90度，进行第二向电泳。含磺基丙氨酸的成对肽段比原来含二硫键的肽小而负电荷增加，结果偏离了对角线，肽斑用茚三酮显色确定，将未用茚三酮显色显色的肽段分别取下，进行氨基酸分析，然后与多肽链序列比较，即可推算出肽间和肽内二硫键的位置。
利用Edman降解，一次连续测出60-70个残基序列 Edman降解法测定顺序操作程序麻烦，工作量大 蛋白质测序仪：微量测序分析（5 pmol）
纯蛋白质二硫键拆开末端氨基酸测定专一性裂解将肽段分离并测出顺序将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序
作业：某肽经CNBr水解得到三个肽段，这三个肽段的结构分别是：Asn-Trp-Gly-Met, Thr-Leu-Ala, Val-Arg-Tyr-Asn-Met;用胰凝乳蛋白酶水解此肽也得到三个肽段，其中一个为四肽，用6mol/L盐酸水解此四肽只得到(Asp)2 和Met三个氨基酸，试写出此肽的氨基酸排列顺序。（胰凝乳蛋白酶断裂Phe、Trp、Tyr羧基端的肽段）
? Invariant residues（不变氨基酸残基/identities）: 在序列的某些位置上种类不变的氨基
酸残基.
? Variable residues: （可变氨基酸残基）：在序列的某些位置上种类可变的氨基酸残基 Conservative residues（保守氨基酸残基/Positives）:在序列的某些位置上，可替换的相似氨基酸残基 (e.g., Arg?Lys, both of which are positively charged
同源蛋白质（2个含义）：
? 在不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质； ? 具有明显氨基酸序列同源的蛋白质，
例如各种脊椎动物中的氧转运蛋白—血红蛋白。
? Ortholog（直系/垂直同源）: 指位于不同的物种间的，在物种形成过程中源自某一
共同祖先的基因；这类基因通常具有相同的功能，但并非绝对；所以，当比较一对直系同源基因时，可能会发现有的已经丧失了固有的功能或者进化出了新的功能. ? Paralog（旁系/并行同源）:指在一个特定的基因组中(即同一物种中）由于基因复制
产生的同源。通常比较这些基因时，它们可能已经彼此具有了新的（不同）功能，也可能已经成为假基因了.
疏水作用在生理温度范围内随温度升高而加强
超过一定温度后（50-60℃）又趋减弱（水分子有序降低，疏水基团进入水中） 非极性溶剂和去污剂是破坏疏水作用，属变性剂
尿素和盐酸胍既能破坏氢键，又能破坏疏水键，属强变性剂
? 某些二硫键被破坏，蛋白质生物活性丧失
? 另一些二硫键与蛋白活性无关，与维持蛋白质稳定有关
肽键刚性结构
反式比顺式稳定（R基空间位阻） 脯氨酸例外（顺式）
? C-N短于平常，不能旋转 ? 6个原子一个平面
? O 和H成为小的电偶极子
? ?：绕N—Cα键旋转的角度 ? ψ：绕Cα—C键旋转的角度 ? 0 度因位阻作用不存在 ? -180o ≤ ?, ψ ≤ 180o
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N-Cα 和Cα-C键可旋转，计算? 和 ψ值
可允许的? 和 ψ值：拉氏构象图，判断结构模型正误
针对非甘氨酸来说，如是甘氨酸(R基为H原子)，范围会扩大很多（7.7%与20.3%） 由于空间位阻，肽链实际构象的范围是非常有限的
一般认为驱动蛋白质折叠的主要动力：熵效应
结果：疏水基团埋藏在分子内部，亲水基团暴露在分子表面 矛盾:疏水核心会带入部分亲水的主链
能量平衡：分子内部主链极性基团被氢键中和，分子表面主链极性基团与水形成氢键
L氨基酸既可以形成右手α-helix也可形成左手α-helix，但天然α-helix全部为右手a-helix
右手比左手稳定！右手螺旋空间位阻较小。
注意
(1) 第n个氨基酸α-氨基上的H与第n+4个氨基酸上的α-羰基O形成氢键，使α-helix
内部的氢键数目达到最大；
(2) α-helix只能由L氨基酸或D氨基酸构构成，天然蛋白的α-helix当然只能由L氨基
酸构成；
(3) 影响α-helix稳定的因素：相邻R基团间的静电作用、范德瓦尔斯作用、疏水相互作
用或位阻作用；
影响?-螺旋形成的因素
①R基大小：较大的难形成，如多聚Ile
甘氨酸由于侧链太小，构象不稳定，是α螺旋的破 坏者 （Coiled structure）； ②R基的电荷性质：不带电荷易形成；连续存在带相同电荷的氨基酸残基；（多聚Ala、Lys、Glu？）
③ Pro吡咯环的形成（α-helix N-末端和C-末端紧邻氨基酸R基团的性质对螺旋稳定性的影响 ？？）
C? -N /C -N不能旋转 无法形成链内氢键
在一个连续的螺旋中80个氨基酸的多肽链有多长？ 5.4 ?/3.6 ×80=120?
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由4个连续的AA残基组成 第一个残基C=O 第四个残基NH
β转角蛋白
? 主要存在于球状蛋白分子中（约1/4） ? 多数处在蛋白质分子的表面
? 脯氨酸因自身结构角度迫使beta转角出现，甘氨酸因为灵活容易出现beta转角
圆二色性与椭圆率
若光学活性物质能吸收某一波段的光，则对左右旋圆偏振光具有不同的吸收率，即圆二色性（circular dichroism）。因此，左右旋圆偏振光的振幅不再相等，出射光将成为椭圆偏振光（入射光为平面偏振光或左右旋偏振光）。
纤维状蛋白质
? 是支架和外保护，规则的线性结构。含有一种二级结构元件 ? 占脊椎动物体内蛋白质总量的一半或一半以上。
毛发结构元件：Alpha螺旋，初原纤维（三股右手向左缠绕，2nm），微原纤维（9+2电缆模式，8nm），大原纤维（200nm）
?-角蛋白的伸缩性能很好：
被过度拉伸时氢键被破坏不能复原。此时?-角蛋白转变成?-折叠结构，称为?-角蛋白（限于软角蛋白） ?
α-角蛋白：毛发中主要蛋白质，伸缩性能好，氢键和二硫键，二硫键数目越大，刚性越强，如犀牛角（18%）。
烫发：还原 卷发 氧化
?角蛋白在湿热条件下伸展转变为?—构象， 冷却干燥时可自发地恢复原状。
? 侧链R基一般较大，不适于处在?—构象 ? 螺旋多肽链间有着很多的二硫键交联 ——交联键使外力解除后肽链恢复原状
胶原蛋白
1．脊椎动物和无脊椎动物体内含量最丰富的蛋白质，属结构蛋白质。 2.使腱、骨、软骨、牙、皮和血管等结缔组织具有机械强度。 3．胶原蛋白的组织分布与类型：I型——XII型。 ?-chain:
特有的次级结构（左手螺旋），不是α-螺旋，更伸展，左手 ?-chain 每个残基上升 0.29nm 三股右手螺旋
肽链氨基酸组成特点：Gly-X-Y重复序列，X常见为Pro或Leu，Y常见为HyPro
胶原蛋白（Collagen）中的AA 1.皮肤中Gly（33%）, Pro（13%）, 4-OH-Pro（9%）, 3-OH-Pro （0.1%）, 5-OH-Lys （0.6%） 2.不常见氨基酸是多肽链合成后由Pro和Lys修饰而成。 （酶：氧，Vc，α-KG，Fe（二价））
3.胶原蛋白是糖蛋白，少量糖与5-OH-Lys的—OH共价连接。
胶原蛋白分子间通过Lys和HyLys交联形成胶原纤维 ?
随着年龄增长，在原胶原的三股螺旋内和三股螺旋间形成的共价交联越来越多，使得结缔组织的胶原纤维越来越硬而脆，改变了肌腱、韧带和软骨的机械性能，使骨头变脆，眼球角膜透明度降低。
丝心蛋白：
反平行式β折叠片 抗张强度高 质地柔软 不能拉伸
? 侧链交替地分布在折叠片的两侧
? 伸展肽链沿纤维轴平行排列成反向?-折叠 ? 分子中不含?-螺旋
? 肽链常由多个六肽单元重复而成
-（Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala）n
? 很高的抗张强度：Gly和Ala片层表面彼此连锁—张力并不直接作用于肽键； ? 柔软特性：非键合的范德华力维系（弱），无二硫键； ? 不能拉伸：肽键处于相当伸展的状态。