花青素提取工艺的研究现状及发展趋势
摘要：花青素(Anthocyanidin) , 又称花色素, 是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素, 属黄酮类化合物[ 1~ 4] 。也是植物花瓣中的主要呈色物质, 水果、蔬菜、花卉等五彩缤纷的颜色大部分与之有关。在植物细胞液泡不同的pH 值
[ 2, 3]
条件下, 使花瓣呈现五彩缤纷的颜色 。在酸性条件下呈红色, 其颜色的深浅与花青素的含量呈正相关性, 可用分光光度计快速测定, 在碱性条件下呈蓝色。花青素的颜色受许多因子的影响, 低温、缺氧和缺磷等不良环境也会促进花
[ 5~ 7]
青素的形成和积累。 关键词：花青素 发展趋势 应用现状 1 花青素
在自然状态下, 花青素在植物体内常与各种单糖结合形成糖苷, 称为花色苷( Anthocyanin) , 由Marguart (1853) 命名矢车菊花朵中的蓝色提取物时提出来的, 现在作为同类物质的总称[2, 3]。花青素广泛存在于开花植物( 被子植物) 中, 据初步统计, 27 个科, 73 个属植物中含花青素。含花色素的山葡萄3. 5 万t, 蓝靛果1. 8 万t, 不少天然色素是综合利用的产物。最早而最丰富的花青素是从红葡萄渣中提取的葡萄皮红, 它于1879 年在意大利上市[ 4, 8, 9]。从天然野生果实蓝靛果中提取出来的一种花青素( 矢车菊素) , 其主要用于食品着色方面, 也可用于染料、医药、化妆品等方面[10]。花青素作为一种天然食用色素, 安全、无毒、资源丰富, 而且具有一定营养和药理作用, 在食品、化妆、医药等方面有着巨大的应用潜力。但是和其他天然色素一样, 其染色力弱, 使用剂量大, 不稳定( 易受pH、氧化剂、亲核剂、酶、金属离子、温度、光照等影响) , 使其应用受到一定限制[ 4, 11, 12]。大量研究表明: 花青素具有抗氧化、抗突变、预防心脑血管疾病、保护肝脏、抑制肿瘤细胞发生等多种生理功能[ 2, 3] 。 花青素存在于植物的果实、花、茎和叶中的液泡内, 是植物体内的一种水溶性色素。由于各种花青素分子结构上的差异或酸碱度的不同, 花青素就显出红、紫、蓝等不同的颜色。当气温低或缺少磷营养时, 有些植物的茎、叶就会变成紫红色, 这是因为叶片里的碳水化合物转变成花青素的缘故; 秋天的红叶也是叶片的花青素引起的[13]。目前食品工业上所用的色素多为合成色素, 几乎都有不同程度的毒性, 长期使用会危害人的健康, 因此天然色素就越来越引起了科研领域的关注。由于至今国内市场上还没有花青素纯品, 所以提取高纯度的花青素对花色苷类色素的深入研究与开发提供必备的表征条件和理论依据, 并且有助于它的工业利用[10] 。
2 花青素的研究现状及发展趋势
2.1 花青素的植物来源及应用
葡萄皮是花色苷类色素的主要原料, 其他属于此类色素并具有开发前景的有胡萝卜素、高粱红色素、山楂红色素、黑米红色素、牵牛红色素、鸡冠花红色素, 越橘红色素。已经投入商业生产色素有葡萄皮色素、浆果类( 草莓、木莓、杨梅、枸杞) 、紫玉米、萝卜红、蓝靛果、越橘红、黑米红等。在配料酒、糖果、糕点、冰棍、雪糕、冰淇淋、果汁( 味) 饮料、碳酸饮料中加入, 用量0. 5%~ 5%。另外也可用于化妆品, 如红色花青素做口红。这些商品用色素(除葡萄皮色素外) 共同特征是对光、热、氧稳定性好, 对微生物稳定, 一般溶于水和乙醇, 不溶于植物油[ 4, 8]。
2.2 花青素的种类、结构与特性
花青素的基本结构单元是22苯基苯并吡喃型阳离子, 即花色基元。现已知的花青素有20 多种, 主要存在于植物中的有: 天竺葵色素( Pelargonidin)、矢本菊色素或芙蓉花色素( Cyanidin)、翠雀素或飞燕草色素( Delphindin)、芍药色素( Pe2 onidin)、牵牛花色素( Petunidin) 及锦葵色素(Malvidin) 。自然条件下游离状态的花青素极少见, 主要以糖苷形式存在, 花青素常与一个或多个葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等通过糖苷键形成花色苷。已知天然存在的花色苷有250 多种[ 2~ 4, 8] 。花青素分子中存在高度分子共轭体系, 具酸性与碱性基团, 易溶于水、甲醇、乙醇、稀碱与稀酸等极性溶剂中。不溶于乙醚、氯仿等有机溶剂, 遇醋酸铅试剂会沉淀, 并能被活性炭吸附。在紫外与可见光区域均具较强吸收, 紫外区最大吸收波长在280 nm附近, 可见光区域最大吸收波长在500~ 550 nm范围内。花青素类物质的颜色随pH 值的变化而变化, pH < 7 呈红色, pH 在7~ 8 时呈紫色, pH> 11 时呈蓝色。 2.3 花青素的分离与分析
植物花青素多采用酸性的甲醇、乙醇、水等极性溶剂提取, 但该法同时提取了材料中由原花青素及花白素转化形成的花青素。提取液中用溶剂萃取、纸层析、柱层析方法分离纯化。采用纸层析或柱层析方法分离, 得到3 种主要的花青素苷元。花青素总量测定多采用分光光度法, 样品经沸水提取, 加酸性乙醇显色, 生成特有的刚果红, 于波长535 nm处测吸光度, 该法不受黄酮苷及儿茶素的干扰, 但受原花色素、花白素干扰, 分析结果往往偏高, 灵敏度不够理想[2] 。已有采用高效液体相色谱法(HPLC) 测定花青素种类和含量的报道。D. Strack 等从欧洲越桔花青素提取物中分离检测到16 种花色苷, 孙视等从引种越桔中检测到15 种花色苷, 色谱分析条件为: 采用Aquapore RP2300 色谱柱, 10% 甲酸水溶液做A 泵流动相, 流速1ml/min, 柱温28 e , 检测波长530 nm, 经梯度洗脱, 在65min 内完成检测。采用矢车菊232葡萄糖苷作为对照品进行方法考察显示: 方法线性关系、重现性良好, 准确度较高 。 2.4 花青素的生物合成途径
20 世纪80 年代末90 年代初, 植物花青素及类黄酮物质代谢途径研究已较为成熟。苯丙氨酸是花青素及其他类黄酮生物合成的直接前体, 由苯丙氨酸到花
青素经历3 个阶段: 第1 阶段由苯丙氨酸到香豆酰CoA, 这是许多次生代谢共有的, 该步受苯丙氨酸解氨酶(PAL) 基因活性调控。第2 阶段由香豆酰CoA 到二氢黄酮醇, 是类黄酮代谢的关键反应, 该阶段产生的黄烷酮和二氢黄酮醇在不同酶作用下, 可转化为花青素和其他类黄酮物质。第3 阶段是各种花青素的合成[2]。
2.5 花青素生物合成的基因工程
利用蛋白质纯化、转座子标签、PCR 及鉴别筛选等手段从玉米、金鱼草、矮牵牛等植物中分离并克隆了部分与花青素生物合成相关的结构基因与调节基因。已分离与克隆的结构基因主要有CHS、CHI、DFR、ANS、3GT、AMT 基因。已克隆的调节基因主要有R 基因及其同族的C、Sn 和Lc 基因, 另外还有B、Cl、Pl、Vpl、Del、An2、An4 基因, 并发现这些调节基因具高度相似序列, 表明不同物种花青素生物合成由相似因子介导与控制[ 2, 14~ 16] 。通过外源结构基因导入, 利用反义基因法与共抑制原理等技术调控花青素等类黄酮物质的合成, 从而改变植物花色、果色与叶色已经取得许多成果[2] 。人们根据植物花的颜色与类黄酮有关, 而苯基乙烯酮合酶CHS 是类黄酮生物合成的关键酶, 于是从矮牵牛中分离出CHS 的cDNA, 将cDNA 与CaMV 的35S 启动子反向连接, 再把此反义基因系统连到双元载体Bin19 上, 得到矮牵牛转基因植株, 其花色从原来的紫红色变为粉红色, 并夹有杂白色或全白色, 这种反义RNA 技术为园艺学育种提供了一条新途径[ 7] 。此外, 花青素代谢调控基因在植物基因工程技术上有重要应用价值, 它是众多植物遗传转化报告基因中最方便的一种。将其导入植物细胞之后, 细胞会变成红色, 用一般解剖镜甚至肉眼即可观测, 无需因组织化学测试而杀死植物组织。由于其易于观察的特性, 花青素调控基因可用于研究植物基因表达及相互作用, 植物遗传条件的优化上[2] 。 2.6 花青素的生理及保健功能
由WHO/ FAO组成的食品添加剂联合专家委员会( JEC2 FA)考察了花色苷的毒理学资料, 结论是/ 毒性很低0。唯一的负面作用是使一些动物器官(肝、肾上腺、甲状腺) 的重量和体重下降。1982 年确定其人体ADI 值( 每日允许摄入剂量) 为0~ 2. 5mg/ kg 体重[3] 。有证据表明, 花青素不仅无毒和无诱变作用, 而且有治疗特性。花青素在眼科学, 治疗各种血液循环失调疾病, 发炎性疾病上有疗效。最近关注花青素和相关类黄酮物质的抗氧化特性, 导致许多文章报道它们在减少冠心病方面的作用, 引发了调查所谓的/ 法兰西怪事0。即法国人食用高
[ 4, 8]
饱和脂肪酸, 却很少人患冠心病 。 2.6.1 抗氧化
花青素是羟基供体, 同时也是一种自由基清除剂, 它能和蛋白质结合防止过氧化。也和金属Cu2+ 等螯合, 防止VC 过氧化, 再生VC, 从而再生VE, 也能淬灭单线态氧。花青素能与金属离子螯合或形成花青素- 金属Cu- Vc 复合物。用氧自由基吸附系统(ORAC) 表示水果中抗氧化能力。与花青素线性相关, 相关系数rxy= 0. 77; 与总酚含量线性相关, 相关系数rxy= 0. 92。另一份研究指出, 抗氧化能力与花青素含量线性相关, 相关系数rxy= 0. 90; 与总酚含量线性相
关, 相关系数rxy= 0. 83,Vc 抗氧化贡献率仅为0. 4% ~ 9. 4%, 说明花青素是类黄酮物质中重要一类[ 4,8] 。Wang 等用氧自由基吸附系统(ORAC) 评价了天竺葵色素等14 种花色苷的清除过氧自由基(ROO* ) 的能力, 结果证明所有的花色苷都具有明显的清除作用( 相关系数r 都大于0. 98)。红葡萄酒中的花色苷清除超氧自由基(O2#)的能力比单宁还高, 而且一定聚合度的花色苷比单个花色苷分子的清除效果更好。目前, 许多证据表明自由基可导致脂肪、蛋白质和核酸的氧化损害, 是一些疾病如癌症、心血管疾病和神经性疾病的重要病因。故花色苷的抗氧化活性对这些疾病的预防, 可能起到非常重要的作用[ 3] 。 2.6.2 抗突变
Yomshimoto 用鼠伤害杆菌TA98 为材料, 评价了4 种甘薯块根水提取物的抗突变活性。发现特别是紫肉甘薯(Ayamurasaki) 中的花色苷可有效地抑制杂环胺、32氨基2 1, 42二甲基25 氢2吡哆2(4, 32b) 吲哚、32氨基212甲基25 氢2吡哆2 (4, 32b)吲哚和22氨基232甲基眯唑( 4, 52f)喹啉引起的突变作用。实验强调特别是酰基化的花色苷具有强烈的抗突变作用。 2.6.3 预防心脑血管疾病, 保护肝脏
从红葡萄酒中提取的花色苷能有效地清除超氧自由基和羟自由基( OH# ) 。在体外实验中, 花色苷能明显抑制低密度脂蛋白的氧化和血小板的聚集, 而这两种物质却是引起动脉粥样硬化的主要因子。Wang 等用白草枯( C12H14Br2N2 , 一种除草剂) 引起鼠肝损害, 用0. 1% 或0. 2%的花色苷可显著降低对鼠肝细胞的损伤, 证明花色苷对肝脏具有保护作用[ 3]。 2.6.4 其他
Wang 引述了一些对花色苷疗效的报道, 如花色苷可用于治疗抗糖尿病性视网膜病、乳房囊肿, 治疗由毛细血管脆弱引起的微循环疾病, 保持血管的正常透性。还可以用于预防胆固醇引起的兔的动脉粥样硬化, 作为肿瘤抑制剂、血管保护剂、辐射防护剂及抗发炎剂等。Nair 也提出花色苷及降解产物在减轻疼痛和预防癌症方面具有一定的功效[3] 。 3 花青素的植物组织培养技术
用食品生物工程技术可实现花青素工业化生产。作为种蚯蚓体内能分离出至少2种以上具有抗凝活性但是分子量和生化特征不相同的蛋白酶。例如在粉正蚓( 程牛亮等, 1990)、赤子胜爱蚓(熊焱等, 1999) 体内均分离出多种纤溶酶组分。这些蛋白酶不仅分子结构、分子量上不同, 而且对底物作用方式和作用位点也有很大差别。粉正蚓的纤溶酶中有的可以水解碱性氨基酸, 有的可以水解酸性氨基酸提出赤子胜爱蚓纯化的组分中有的可以直接水解纤维蛋白, 也有的以纤溶酶原作为水解底物。日本宫崎医科大学的美原恒教授, 利用蚯蚓提取蛋白酶获得了成功, 此药可以代替尿激酶, 是治疗心肌梗塞、脑血栓的特效药。口服蚯蚓水提物30ml/ d, 14 d( 1 个疗程)后, 脑血栓患者的血液流变学指标明显改善。董德洛等(1993)给脑血栓患者口服蚯蚓水提物实验发现, 该提取物可能通过抗凝
及促纤溶作用, 促进脑血栓患者神经功能缺损的恢复。陈飞等(2003) 指出蚯蚓的溶栓作用, 侧重于脑血管病的预防和中风后遗症的恢复。蚯蚓消化道中有10 多种蛋白水解酶和纤溶酶。利用这些酶水解蛋白可获得可溶性小分子的活性肽和氨基酸。蚯蚓提取物中钙调素, 通过介导Ca2+ 信号传导, 它在调节细胞多种生理功能中起重要作用。蚯蚓CaM是一种分布很广泛, 功能重要的钙结合蛋白, 作为主要的钙受体蛋白, 调节着20 多种酶的活性, 在第二信使调节系统中处于重要位置。
植物一种次生代谢物质, 可用组织培养技术生产, 目前报道的有苹果、葡萄、紫苏、玫瑰茄、矢车菊、胡萝卜等。天然植物中花青素含量很少, 为提高产率, 研究了细胞悬浮培养条件与细胞生物和花青素产率的关系。进行植物细胞培养也可研究植物次生代谢途径, 二者共同促进。已知光可诱导花青素合成, 低温可促进花青素积累。光诱导花青素合成的酶有PAL( 苯丙氨酸解氨酶) 、CHS( 查尔酮合成酶) 、CHI (查尔酮异构酶) 、UFGT( 尿苷二磷酸类黄酮糖苷转移酶) 等, 其他重要的酶有F3H( 黄烷酮羟化酶) 、DFR( 二羟黄酮醇还原酶)、ANS( 花青素合成酶) [ 12] 。光诱导花青素的合成是以隐花色素作为其受体。玫瑰茄组培方面, 报道蓝光( 420~ 530 nm) 是促进玫瑰茄细胞合成花青素最有效的单色光, 体现了/ 蓝光效应0。花青素作为一种次生代谢物, 是细胞稳定期合成的。工业化生产建议采用分段式培养: 第一步暗培养以增加细胞生物量, 第二步补充新鲜培养液, 光诱导花青素合成[ 15~ 18] 。 4 展望
近年来与花青素合成有关的重要酶的结构基因和调节基因已从矮牵牛、金鱼草、玉米等植物中克隆出来, 并应用于花卉育种, 这是目前花青素研究的热点[ 14~ 18]
。同时因花青素独特的生理功能, 从植物中分离、纯化或应用生物工程技术得到花青素类物质并应用于食品、医药领域成为花青素研究的又一热点[ 23] 。近些年合成食用色素的应用受到越来越多的限制, 花青素作为安全的天然色素将日益受到消费者的青睐[ 19~ 23] 。
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