生物化学实验报告
姓 名：
学 号：
专业年级：
组 别：
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称 实验日期 合作者 评分 XX 血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定 实验地点 指导老师 教师签名 李某某 批改日期 2013-06-03 格式要求：正文请统一用：小四号，宋体，1.5倍行距；数字、英文用Times New
Roman；标题用：四号，黑体，加粗。需强调的地方请用蓝颜色标出。不得出
现多行、多页空白现象。 一、实验目的
1、掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法。 2、掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法。 3、了解柱层析技术。
二、实验原理
1、粗提（盐析法）：
蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：表面的电荷和水化膜。当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出。盐在水溶液中电离所形成的正负离子可吸引水分子，从而夺取蛋白质分子上的水化膜，还可中和部分电荷使蛋白质分子聚集而沉淀，从而达到盐析沉淀蛋白质的目的。由于血清中各种蛋白质颗粒大小、所带电荷多少及亲水程度不同，因此，利用不同浓度的硫酸铵溶液分段盐析，便可将血清中清蛋白和球蛋白从溶液中沉淀出来，达到初步分离清蛋白、球蛋白的目的。 2、脱盐（凝胶层析法）
凝胶层析法利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。当溶液通过凝胶柱时，溶液中分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，
所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱。而盐的分子量较小，可通过网孔进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，较晚流出层析柱。从而可达到去盐的目的。
3、纯化（离子交换层析法）
离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。
脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们的等电点的不同可进行分离。血清中各种蛋白质的pI各不相同，因此，在同一醋酸铵缓冲液中，各蛋白质所带的电荷不同，可以通过DEAE离子交换层析将血清清蛋白和γ-球蛋白分离出来。 4、纯度鉴定（电泳）
采用醋酸纤维素薄膜电泳对分离得到的清蛋白和γ-球蛋白进行纯度鉴定，以正常血清样品作对照。比较两者电泳图谱可定性判断纯化的清蛋白和γ-球蛋白的纯度。
三、材料与方法：以流程图示意
材料：
1、样品：健康人血清（新鲜、无溶血、无沉淀物或细菌滋生）
2、试剂：0.3mol/L的PH6.5醋酸铵缓冲液、0.06mol/L的PH6.5醋酸铵缓冲液、0.02mol/L的PH6.5醋酸铵缓冲液、1.5mol/L的NaCl-0.3mol/NH4Ac溶液、饱和硫酸铵溶液、0.92mol/L（20%）磺基水杨酸、0.05mol/L（1%）BaCl2溶液、氨基黑染色液、巴比妥缓冲液、漂洗液。
3、仪器及器材：层析柱、烧杯、移液枪、加样枪、试管、滤纸、醋酸纤维素薄膜、黑色反应板、铁固定架、螺旋夹、离心管和离心机、培养皿、载玻片、滤纸、平头镊子、电泳槽、直流稳压电泳仪。
方法：
粗提 （盐析法） 脱盐 （凝胶层析法） 纯化 （离子交换层析法） 纯度鉴定 （电泳） 盐 析 取血清0.8ml，边摇边缓慢滴加饱和硫酸铵溶液0.8ml，混匀室温放置10min，4000r/min离心10min 沉淀（含球蛋白）加水 0.6ml溶解 上清液（含清蛋白、少量α球蛋白和β球蛋白) 过葡聚糖凝胶G-25层析柱（1.0×7cm） 用1ml 0.02mol/L NH4Ac缓 冲液清洗层析柱内壁,继续 用0.02mol/L pH6.5 NH4Ac凝 缓冲液(2ml)洗脱，流出液量 约1ml时开始检测蛋白质 胶 磺基水杨酸 检测蛋白质 柱 收集含有蛋白质的峰液12d 层 此时磺基水杨 酸和BaCl2检测系 可能同时阳性 继续用2ml 0.02mol/L 除 NH4Ac缓冲液洗涤 盐 BaCl2检测SO42-阴性 用2~3ml 0.02mol/L NH4Ac缓冲液再生平衡 过葡聚糖凝胶G-25层析柱（1.0×7cm） 用1ml 0.02mol/L NH4Ac缓冲液清洗层析柱内壁,继续用0.02mol/L pH6.5 NH4Ac缓冲液(2ml)洗脱，流出液量约1ml时开始检测蛋白质 磺基水杨酸检测蛋白质 收集含有蛋白质的峰液12d 此时磺基水杨酸和BaCl2检测可能同时阳性 继续用2ml 0.02mol/L NH4Ac缓冲液洗涤 BaCl2检测SO42-阴性 用2~3ml 0.02mol/L NH4Ac缓冲液再生平衡 离子交换柱层析纯化
除盐后收集的球蛋白 离 子 交 换 柱 层 纯 化 过DEAE-纤维素层析柱（1.0×6cm） 除盐后收集的清蛋白 过DEAE-纤维素层析柱（1.0×6cm） 用1ml 0.02mol/L NH4Ac缓冲液清洗层析柱内壁,继续用0.02mol/L pH6.5 NH4Ac缓冲液(3ml)洗脱，流出液量约1ml开始检测蛋白质 磺基水杨酸检测蛋白质 收集含有蛋白质的洗脱液每管10d，连续收集3管 用1ml 0.0６mol/L NH4AC缓冲液清洗层析柱内壁,用约５ml 0.06mol/L NH4AC缓冲液流洗，除去α球蛋白和β球蛋白 用0.3mol/L NH4AC缓冲液(约3ml)洗脱，流出液量约2ml开始检测蛋白质 磺基水杨酸检测蛋白质 收集含有清蛋白的洗脱液每管10d，连续收集2管 DEAE-纤维素柱不用再生，可直接用于纯化清蛋白 离子交换柱再生和蛋白纯度鉴定 取浓度最高的1管作纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳法） 2管均作纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳法) DEAE-纤维素柱先用6ml l.5mol/L NaCl - 0.3mol/L NH4Ac溶液流洗，再用10ml 0.02mol/L NH4Ac缓冲液流洗再生平衡 电 泳 纯 度 鉴 定 准备 将浸泡在巴比妥缓冲液中的醋酸纤维薄膜用镊子取出，用滤纸吸去多余的缓冲液，在粗面一端1.5cm处用铅笔画上一条横线为点样线。 点样 用盖玻片一端沾取2~3μl待测新鲜样品，然后将沾有样品截面与纤维素薄膜点样线处轻轻接触，待血清完全渗入薄膜后移开。 电泳 将薄膜架在电泳槽上，点样面朝下，点样端置阴极，盖上电泳槽盖。电泳50min。 染色 将氨基黑染色液倒入培养皿中，用镊子取出薄膜浸入染液中，染色5min。 直至背景无色为止。 漂洗 从染色液中取出以染好的薄膜放入漂洗液中反复漂洗3~4次，