四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑
推论，并得出结论。 结果：
1、粗提（盐析法）:如图1所示，往血清中缓慢滴加饱和硫酸铵溶液后，溶液变浑浊，呈乳白色。离心后，溶液分为上层的上清液和下层沉淀，上清液呈浅黄色（见图3），沉淀为白色。如图2所示，使用移液枪吸取上清液，从而分离上清液和沉淀。沉淀加水后溶解，为无色溶液（见图4）。
图1 血清加饱和硫酸铵溶液 图2 分离上清液和沉淀
图3 上清液 图4 沉淀加水后溶解
2、脱盐（凝胶层析法）和纯化（离子交换柱层析鉴定）：如图5所示，往层析柱中加样前，应先将层析柱中的上层液放出，用小烧杯接废液，直至下液面离柱床约0.5cm。与葡聚糖凝胶G-25层析柱相对比，DEAE-纤维素层析柱的液体流出速度更缓慢。如图6所示，往磺基水杨酸和BaCl2溶液中分别滴入流出液，生成白色沉淀，说明流出液中含有蛋白质。白色沉淀越多，说明液体所含的蛋白质越多，以此选取浓度最高的1管球蛋白进行醋酸纤维素薄膜电泳。
图5 DEAE-纤维素层析柱 图6 磺基水杨酸和BaCl2检测蛋白质呈阳性
（红色圆圈为磺基水杨酸，蓝色圆圈为BaCl2溶液） 4、纯度鉴定（电泳）：如图7所示将醋酸纤维素薄膜架于电泳槽上，进行电泳。如图8所示，染色后，薄膜上可见5条深蓝色横纹。
图7 直流稳压电泳仪
α1α2β
清球球球蛋蛋蛋蛋 白 白 白 白
γ
球蛋白
点样线
血清
清蛋白第1管
清蛋白第2管
γ-球蛋白
图8 血清清蛋白、γ-球蛋白纯度鉴定的电泳图谱 讨论： 1、操作失误：
1）在进行球蛋白的除盐时，我们倒入球蛋白溶液后没有打开夹子让其进入凝胶柱，而是接着倒入了1ml 0.02mol/L NH4Ac缓冲液，导致球蛋白被稀释。 2）血清中各组分分离结果不佳，可能是点样过多。
3）电泳图谱不整齐，可能是点样不均匀，或电泳时薄膜未放正。 2、注意事项：
1）使用移液枪吸取上清液时，应注意从大往小调节吸取体积，小心吸取，避免吸取沉淀物。
2）使用层析柱时，注意不要让液面低于凝胶床/纤维素床表面，以免空气进入凝胶床/
纤维素床。
3）往层析柱加液体时，注意不要将凝胶粒/纤维素粒冲起，破坏凝胶床/纤维素床表面的平整。
4）往层析柱加不同液体时，应先让上一种液体进入柱床后再添加另一种液体，否则样品会被稀释，缓冲液等液体会失去其该有的作用。
5）流出一定量液体时，要及时用磺基水杨酸和BaCl2检验流出液是否含有蛋白质，以免蛋白质流失过多。
6）点样线应窄于薄膜宽度，以免发生边缘效应。
7）点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能太干，否则样品不易进入薄膜的网孔，导致电泳起始点参差不齐，影响分离效果。
8）点样线应窄而均匀，否则电泳图谱会不整齐。
9）点样时应做好标记，以免弄混。标记要明显，以免染色漂洗后标记模糊消失。 3、讨论题：
1）硫酸铵盐析一步,为什么是0.8ml血清加0.8ml饱和硫酸铵?
在半饱和硫酸铵溶液中，血清清蛋白不沉淀，γ-球蛋白沉淀，0.8ml血清和0.8ml饱和硫酸铵混合可以形成半饱和硫酸铵溶液从而达到分离的目的。但硫酸铵会水解呈酸性，如果浓度大的话酸性也很强，可能使蛋白质变性。若将血清加入饱和硫酸铵，会使部分血清蛋白变性。所以要将硫酸铵慢慢加入血清，边滴加边摇匀。
2）为什么实验中DEAE纤维素柱分离γ-球蛋白后不用再生,可直接用于纯化清蛋白? DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可与其进行交换结合，带正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。γ-球蛋白带正电荷，不与DEAE结合，会从层析柱中首先洗脱出来，所以可直接用于纯化清蛋白。
3）应用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定分离纯化后的血清清蛋白和γ-球蛋白的纯度,根据什么
来确定它是清蛋白还是γ-球蛋白?判定它们纯度的依据是什么?
正常人血清蛋白经醋酸纤维素薄膜电泳后可获得5条区带。γ-球蛋白的等电点约为7.3，在pH8.6的巴比妥缓冲液中，带的负电荷最少，在电场中比其它蛋白质移动速度慢。而清蛋白等其它蛋白质的等电点均小于7.3，在电场中比γ-球蛋白移动速度快。其中清蛋白等电点为4.88，带负电荷最多，速度最快。且清蛋白在血清中含量最多。所以离点样线最近的是γ-球蛋白，离点样线最远的最粗的线是清蛋白。血清的电泳图谱上，从正极端开始分别为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白。对比血清的电泳图谱与样品的电泳图谱上区带的位置，可知样品中含有哪种蛋白。
经纯化后的清蛋白和γ-球蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳图谱上，若仅在清蛋白和γ-球蛋白位置上出现区带，说明纯度高；若在其它蛋白位置上出现区带，说明纯度低，含有杂蛋白。