烟草叶片的组织培养
一、实验目的
本实验通过配制3种不同的培养基来实现烟草种子苗叶片诱导、分化及植株再生从而深刻理解植物细胞的全能性、学习和掌握植物组织培养技术，
二、实验原理
植物组织培养是从20世纪30年代初期发展起来的一项生物技术。由于其拥有占地少、繁殖系数大等特点，现以在全世界的园林植物尤其是花卉的种苗繁育上得到广泛应用。本文着重介绍组织培养技术的理论原理、操作过程、生产技术以及经济核算等方面的内容，使大家对组织培养在园林植物尤其是花卉的种苗繁育的应用有所了解，为以后的实际操作提供依据。
在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。
培养基配方设计是组培法育苗中的关键步骤。根据理论与实际经验，对不同种类的花卉及不同的取材部位，需设计出相适应的配方，并从中筛选出最佳者。
继代芽增殖培养：很多花卉植物经过2-6 周的培养即可分化出大量的不定芽。根据情况可以将这些增殖了大量新芽的外植体重新分割进行几代培养，以扩大繁殖规模直至满足繁殖需要为止。
三、实验材料
植物材料：烟草植株
药品： 激素（2,4-D、NAA、6-BA浓度均可）、 1N NaOH、 1N HCl 蒸馏水 、 70%酒精、 0.01%升汞
仪器：1 玻璃杯 、1玻璃棒、1pH试纸(5.5-9.0) 1瓶无菌水、1个无菌烧杯、1母液 成 分 浓缩 母液 配制1升规定量 倍数 称取量体积培养基吸包无菌滤纸、 1个无菌白瓷板 、 培养瓶若干超净工作台、 酒精灯、 解剖刀、 镊子
四、实验方法与步骤
4.1 MS培养基母液的配制
移液器、微波炉、灭菌器、 编种号 类 1 大量元KNO3 NH4NO3 MgSO4·7H2O 1900 1650 370 170 440 22.3 8.6 6.2 0.83 10 10 10 10 10 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 19000 16500 3700 1700 4400 2230 860 620 83 25 2.5 2.5 3730 2780 100 25 5 25 5000 500 10 500 10 1000 10 1000 1000 100 10 1000 100 素 KH2PO4 2 3 微量元CaCl2·2H2O MnSO4·4H2O ZnSO4·7H2O H3BO3 KI Na2MoO4·7H2O 0.25 0.025 0.025 37.3 27.8 2.0 0.5 0.1 0.5 100 素 CuSO4.5H2O4 CoCL2.6H2O 4 铁Na2-EDTA 盐 FeSO4.4H2O 5 有机甘氨酸 盐酸吡哆醇 盐酸硫铵素 物 烟酸 6 肌酸 注意：
1．大量元素按照使用时高10倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除CaCl2·2H2O单独配制外，其余化合物混合在500ml烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。 2．微量元素母液的配制
按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签。
3．铁盐配制将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中，加热，（很重要）不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴
上标签。
4．有机物母液配制，按母液要求浓缩50倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。
5．母液最好在2~4℃的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。
1． 制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须
是高纯度的（分析纯）。
2． 称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。 ．生长调节剂母液配制：
为了操作方便，节约时间，生长调节剂也可如同配制母液一样，先配成原液，这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。
不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA3），2，4-D等生长素和玉米素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加热。激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA）可溶于少量1mol/L的盐酸中，叶酸需用少量稀氨水溶解。
称取50mg生长调节物质，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制的母液每毫升则含有生长调节物质0.5mg，配制后一般要求在低温（0~4℃）保存，配制培养基时如每升（1000ml）需添加的生长调节剂物质为0.5mg时，则取1ml母液即可。
4.2 培养基配制和灭菌 4.2.1培养培养基配制程序
本次实验使用
（1）愈伤组织诱导及其幼芽分化培养基:MS+2,4-D 0.5 mg/L +6-BA 1.0 mg/L； （2）幼芽增殖培养基：MS+6-BA 1.0 mg/L +NAA 0.2 mg/L； （3）生根培养基：MS+NAA 0.2 mg/L。
注意事项：上述培养基均在MS固体培养基溶化后降低到50左右后，加入相应激素所得， MS固体培养基的配置过程在此不作过多赘述
上述培养基均附加3%蔗糖，0.8%琼脂，pH5.8，培养温度25±2℃，光照强2000lx。
(一).母液吸取量的计算
配制培养基的升数
公式1：母液吸取量= 母液体积（CC）×——————————
母液浓缩倍数
培养基要求的含量
公式2：母液吸取量= ———————————（各种生长调节剂）
母液每CC的含量
（二） 各种母液按顺序编号排列
F．生长素萘乙酸（NAA）：配制0.5mg/ml的NAA称取50mg ， NAA用少量95% 酒精溶解后加蒸馏水定容至1000ml；G..细胞分裂素、激动素（KT）配制0.5mg/ml的KT 称50mgKT用少量1N HCL溶解后,加蒸馏水定容至100ml。 (三) 配制培养基（1000ml）
1. 琼脂: 称取5~7g琼脂，加入300ml蒸馏水，加热溶解直至完全溶解为止.
2. 蔗糖3%用质量较好的白糖代替，称取30g白糖，溶于溶有琼脂的300ml蒸馏水
中。
3. 各种母液的吸取（培养基1L）
（1） 用50ml量筒量取大量元素母液（A）和CaCl2·2H2O母液（B）各100ml （2） 分别用10ml移液管或吸管吸取微量元素（C），铁盐（D）母液各10ml （3） 用10ml移液管或吸管吸取有机物（H）10ml （4） 移取激素
将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中，混合均匀后，加热至80℃左右，用酸度计或精密PH试纸测定培养基的PH一般要求5.8~6.0，过酸过碱则用1N NaoH和1N HCL调整。
二．分装：用一个接有胶管的分装器趁热装培养基，1000ml培养基分装到25-30个三角瓶中，每个三角瓶约30ml左右（一般占试管、三角瓶容量1/4~1/3左右）注：培养基勿碰瓶壁。
三. 包装：分装好的三角瓶用封口膜包扎好，标明培养基代号即可进行灭菌。
用具清理和洗涤：各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤干净，然后按次序放回原处。
A. 大量元素；B.CaCl2.2H2O； C.微量元素 ；D.铁盐； E.有机物；