4.2.2 培养基的灭菌——高压蒸汽灭菌（高压蒸汽灭菌锅的使用方
法）
具体操作步骤：
1. 高压锅放水至平把架； 2. 把包扎好的培养基装入高压锅;
3. 盖上热压锅盖,上紧螺帽(注意对角拧紧螺帽)关上气阀和安全阀. 4. 然后接通电源.
5. 压力计升至0.05MPa时，打开放气阀,排除冷空气(此步很重要)。
6. 排除冷空气后,关闭放气阀，待压力升到0.11MPa位置时，开始计算灭菌时间，具体方法：当压力锅指针升至0.12MPa时，关闭电源，待指针下降至0.11MPa时接通电源，不断重复此操作过程，维持20分钟。
7. 灭菌时间达到20分钟后，除去电源，打开放气阀(注意要逐渐放气)待高压锅内的空气完全排除后，打开热压灭菌锅盖(注意对角扭松螺帽)稍待冷后再把培养基取出。
8. 经过灭菌的营养培养基不宜放置太长，应尽早使用，但为了在使用前能检查培养基有无微生物污染，可将培养基置于25℃下保存4天，如果培养基需要贮存较长时间，可在4℃低温下保存。
灭菌高压锅有大型卧式、中型立式、小型手提式等多种型号和规格，无论哪种型号，操作的步骤都很相近。
进水→放进培养基→盖紧锅盖→关上放汽阀→检查安全阀→接上加热源→待压力升至0.05MPa时排锅内冷空气，关上放气阀→0.11MPa(121℃)下灭菌20~25分钟，保持稳定压力→除热源→逐渐打开放气阀→锅内空气排除完后→开放锅盖→稍冷后取出培养基。
4.3植物材料表面灭菌——消毒剂灭菌
从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。 1.接种步骤：
第一步：清理材料→→流水冲洗→→加入吐温（或洗衣粉）清洗 →→自来水冲洗 第二步：对材料的表面浸润灭菌 ： 70%酒精浸10-30秒→→无菌水 第三步：灭菌剂处理→→ 0.1-1%升汞5-8 min（或其他灭菌剂） 第四步：无菌水进行冲洗 注意事项：
１.灭菌剂一般要临时配制，现配现用．升汞可以短期储存．
２.对去除较容易的灭菌剂灭菌后无菌水冲洗３-４次，升汞一般５-８次，每次不少于３min ３.灭菌时要轻轻的搅拌，消除气泡，使消毒更彻底．
４.灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。 ５.灭菌液要充分浸没材料 2.无菌操作可按以下步骤进行：
（1）在接种3天前用甲醛熏蒸接种室，并于接种前3小时打开其内紫外线灯进行杀菌； （2）在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯； （3）接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等； （4）上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。然后搽拭工作台面；
（5）先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；
（6）接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；
材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。（如叶片切成0.5cm2的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1-2片叶原基）在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。
（7）接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。
4.4烟草叶片愈伤组织的诱导和不定芽的分化
? 于超净台中彻底冲洗外植体；70%酒精消毒3min；无菌水冲洗3遍，每
遍3mini；将烟草叶片残留的水分用灭过菌的滤纸吸干；白瓷板上用消毒的解剖刀分割为1-1.5cm2的小块； 接入相应的MS培养基上，每瓶接种4-5块。接入（1）中培养。
? 约2～3d后，叶片外植体卷曲、增厚、膨胀；
? 15d后外植体脱分化形成疏松絮状浅黄绿色的愈伤组织，愈伤组织诱导率
为100%；
? 30d后，从叶片外植体产生的疏松愈伤组织上分化出许多浅黄绿色芽点； ? 60d后，不仅从愈伤组织上分化出越来越多幼芽，芽诱导频率(芽数/块愈
伤组织)为25～35，而且还可观察到，该愈伤组织较早分化产生的幼芽叶片呈现不同程度白化（或缺绿）。但此时若将此缺绿幼芽切下，转接至不加2,4-D的幼芽增殖培养基（2）上，
? 3～5d后即可恢复正常，缺绿症状消失，并可不断增殖，发育成绿色健壮
的小苗。
4.诱导生根及移栽
取约3～4cm长的无根小苗接种于生根培养基（3）中，约7～8d后，几乎所有外植体均从其基部产生白色幼根，根诱导频率为3～5，部分在培养基表面的根具大量白色根毛。当试管苗长至5～6cm高时，打开瓶口，在散射光下放置2d后取出，洗去根部残留培养基，种植于经过消毒的珍珠岩、泥炭土和菜园土等量混合的基质中，成活率可达95%以上。
5．数据记录
烟草叶片愈伤组织诱导情况
编号每瓶接种数愈伤组织诱导率愈伤组织状态染菌率 烟草叶片愈伤组织诱导情况 编号 每瓶接种数 愈伤组织诱导率 愈伤组织状态 染菌率 烟草叶片愈伤组织再生植株情况 编号 分化率 每个愈伤组织分化芽数 分化情况 染菌率 烟草叶片诱导生根情况
编号 生根率 生根情况 再生植株分化根数 染菌率 五、实验结果与分析
1、将观察结果加以描述和统计；对出现诱导失败和污染的情况要加以认真分析，找到原因。 2、绘图或照片
六、思考题
1、外植体脱分化形成愈伤组织的过程中，哪些激素起作用？ 2、如果时间允许，请设计下游诱导愈伤组织分化和再生植株的实验
附录1常用植物激素
类别 名 称 2，4－二氯苯氧乙酸 生 长 素 α－萘乙酸 吲哚－3－乙酸 吲哚－3－丁酸 细 胞 分 裂 6－苄基氨基嘌呤 6－糠基氨基嘌呤 N－异戊烯氨基嘌呤 （玉米素） 缩写词 2，4－D NAA IAA IBA BA KT ZT 分子量 221.0 186.2 175.2 203.2 225.2 215.2 219.2 使用浓度范围 0.001－10mg/L 0.001－10mg/L 0.001－10mg/L 0.001－10mg/L 母液配制 生长素通常用NaOH溶液滴至溶解成溶液。 能溶于乙醇 分裂素通常能溶于稀NaOH，含水乙醇或稀盐酸 说 明 IAA易被植物细胞所氧化。故培养基中很少单独使用。 玉米素不耐热，不能高压灭菌。 赤 霉 素 赤霉素 GA3 346.4 能溶于乙醇 不耐热不能高压灭菌在愈伤组织和悬浮培养物的启动和保持生长时才需要有时小植株再生时也需要 附录2.常用药品的配置方法
1. 1mol/L HCl的配制：根据盐酸的密度37%盐酸溶液的密度为1.19克/毫升，假设要配制1000ml 1mol/L HCl，则需要盐酸的物质的量为1mol，所以需要量取37%的盐酸为1*36.5/37%/1.19=82ml
2. 1mol/L的NaOH的配制：称40gNaOH，然后融于1000ml的蒸馏水中。（定容到100ml）
3. 95%的酒精配制成75%的酒精：用量筒量取750ml的95%酒精加入200ml的蒸馏水即可得到75%的酒精。
如果用无水酒精配制75%的酒精，则量取750ml的无水酒精，再加水250ml。 4. 0.1%的升汞配制：先称取1克升汞粉末，然后用蒸馏水溶解最后定容到1000ml。 5. 1mg/ml的2.4-D的配制：称取0.1g2.4-D，用少量1mol/LnaOH或酒精助溶，然后定容到100ml。
6. 1 mg/ml的6-BA的配制：称取0.1g6-BA，用少量1mol/L HCl或1mol/LNaOH助溶，然后定容到100ml。
7. 0.5mg/ml的NAA的配制：称取0.05gNAA，用少量95%酒精助溶，然后定容到100ml。