2.1.2基本原理
在几种腐败食物中的微生物含量较高，不利于进行微生物的观察，必须对微生物进行分离，以获得一定浓度、分布均匀的微生物菌群。 2.1.3操作步骤
1）在操作台酒精灯火焰边剥开食品外表皮。
2）将接种针火焰灭菌后在火焰边插入食品内部，取出待测样品。 3）将已倾倒好并完全凝固的马铃薯琼脂平板,左手拿起平板底，使培养基朝下，右手持接种针,将待测样品点种在培养基中心点或成三角形的三分点，然后盖上平皿盖,始终保持平板底朝上，放于28℃的恒温培养箱中培养24h；这种方法可避免霉菌孢子散落在培养基上，使菌落生长一个或三个扇形的典型菌落,便于观察。（但我们因对该方法的不熟悉，导致操作失误，每个平板上均点植了过多的菌）
2.2微生物的分离与纯化——倾注法
2.2.1目的要求
1）学会配制营养明胶培养基
2）掌握倾注法分离纯化豆腐、香蕉中的微生物（主要是细菌） 2.2.2基本原理
在几种腐败食物中的微生物含量较高，不利于进行微生物的观察，必须对微生物进行分离，以获得一定浓度、分布均匀的微生物菌群。 2.2.3操作步骤
1）取样 取香蕉、西瓜、豆腐的腐败处约2g，在研钵中研磨成半糊状加蒸馏水充分搅拌混匀（样液）。
2）稀释 根据对样品污染情况的估计，选择2个合适的稀释度，分别在做10
倍稀释的同时，吸取lml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做1个平皿。
3）倾注 然后将凉至45℃左右的培养基注入平皿中。
4）培养 将菌液与培养基充分混匀，待琼脂凝固后，倒置于25～28℃恒温箱
中(环境真菌的最适培养温度为25～28℃,而非37℃)培养24h。
2.3微生物的分离与纯化——涂布法
2.3.1目的要求
掌握涂布法分离纯化豆腐、香蕉中的微生物（主要是细菌） 2.3.2基本原理
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在几种腐败食物中的微生物含量较高，不利于进行微生物的观察，必须对微生物进行分离，以获得一定浓度、分布均匀的微生物菌群。 2.3.3操作步骤
1）取样 取香蕉、豆腐烂处约2g，在研钵中研磨成半糊状加蒸馏水充分搅拌
混匀（样液）。
2）倒平板 在操作台酒精灯火焰旁将营养琼脂培养基倒入无菌平皿中，立即
盖好平皿盖，待其冷却凝固。
3）稀释 根据对样品污染情况的估计，选择2个合适的稀释度，分别在做10
倍稀释的同时，吸取0.lml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做1个平皿。
4）涂布 用涂布棒快速地将其均匀涂布，使长出单菌落而达到分离的目的。 5）培养 待菌液与琼脂牢固的结合后，倒置于25～28℃恒温箱中培养24h。 下图一为涂布法操作过程。
图一
2.4 革兰氏染色
2.4.1目的要求
观察比较不同菌落的微生物革兰氏性状。 2.4.2基本原理
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884 年由丹麦医师Gr 二创立的。革兰氏染色法（Gram stain ）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细
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菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示：染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。
细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肤聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫－碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肤聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫一碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液（basic dye）；媒染剂（mordant) ；脱色剂( decolorising agent）和复染液（counter stain）。用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine) 是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95 ％的酒精（ethanol）。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红或沙黄。 2.4.3操作步骤
1） 涂片 将培养的不同菌分别作涂片，干燥、固定。 固定时通过火焰l～2 次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2）染色 ①初染加草酸铰结晶紫一滴，约一分钟，水洗。
②媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。
③脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95 ％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20 ～30 秒钟，立即用水冲净酒精。
④复染用番红液染1～2 分钟，水洗。
⑤镜检干燥后，置油镜观察．革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。
⑥同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。（ 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌：而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。）
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下图二为革兰氏染色过程。
图二
2.5 糖发酵
2.5.1目的要求
了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作用。 2.5.2基本原理
糖发酵试验是最常用的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖并产酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。
酸的产生可利用指示剂来断定。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫[pH5.2（黄色）～6.8（紫色）]，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵管中倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。 2.5.3操作步骤
1）编号 用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名。 2）接种 取盛有葡萄糖发酵培养基的试管3支，按编号1支接种大肠杆菌，另
1支接种普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。另取乳糖发酵培养基试管3支，同样1支接种大肠杆菌，1支接种普通变形杆菌，第3支不接种，作为对照。
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3）培养 将上述已接种的葡萄萄糖和乳糖发酵试管和对照管置37℃恒温箱中
培养24h。
2.6 霉菌的分离
2.6.1目的要求
了解将霉菌分离辨别的方法。 2.6.2操作步骤
1）制片 在载玻片中央滴加一滴乳酸酚，用接种环蘸取实验平板上判断为霉
菌部位的菌，在乳酸酚中混匀，盖上盖玻片。
2）镜检 用高倍显微镜观察。
3）选取不同形态的菌落分别制片观察。
3 结果与讨论
3.1实验结果及其分析
采用直接制片法和染色法观察培养效果及菌落生长状态。 3.1.1 不同食品中微生物分离培养的菌落的比较
培养结果：如下图三（1）、（2）是香蕉培养菌落，图四（1）、（2）为豆腐培
养菌落，图五为西瓜培养菌落。
图三（1） 点植法 图三（2） 倾注法
图四（1）点植法 图四（2）倾注法
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