木耳菌糠木聚糖酶超声波提取工艺及部分酶学性质研究
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1原料及其处理方法
木耳试验样品取牡丹江市绿珠果蔬技术开发有限责任公司（黑龙江省牡丹江市东安区兴隆镇西村）。随机取10袋木耳菌糠，脱去菌袋，摘掉菌糠表面的菇蕾，搓碎后均匀混合。
2.1.2主要仪器
高速组织捣碎机（DS-1；上海标本模型厂制造）；分光光度计（722N；上海精密科学仪器有限公司）；移液器（10～1000μL）；分析天平（BP-211D；沙多利斯（俄罗斯））；恒温水浴锅（HH-601超级水浴锅；江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；振荡培养箱（HZQ-F160；哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；控温离心机（TGL-ULM；湖南星科科学仪器有限公司）；pH计（PHS-2F；上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂）；烘干箱（GR-146；上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；超声波破碎仪（输出功率100W）（VCX-130；美国Sonics公司）。
2.1.3主要试剂及配制方法
2.1.3.1 3,5-二硝基水杨酸（DNS）溶液
准确称取DNS 6.3g于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/L NaOH溶液262mL，再加到500mL含有185g酒石酸钾钠（C4H4O6KNa ? 4H2O，MW=282.22）的热水溶液中，再加5g结晶酚（C6H5OH，MW=94.11）和5g无水亚硫酸钠（Na2SO3，MW=126.04），搅拌溶解，冷却后移入1 000mL容量瓶中用蒸馏水定容至1 000mL，充分混匀。贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用[4]。 2.1.3.2 0.1mol/L乙酸(CH3COOH)溶液
吸取冰乙酸0.6mL，加水溶解，定容至100ml[5]。 2.1.3.3 0.1mol/L乙酸钠(CH3COONa)溶液
称取无水乙酸钠1.36g，加水溶解，定容至100ml[5]。
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2.1.3.4 0.1mol/L，pH为5.5的乙酸－乙酸钠缓冲溶液
称取无水乙酸钠11.57g，加入冰乙酸0.85ml，再加水溶解，定容至1000ml。测定溶液的pH，如果pH偏离5.5，再用乙酸溶液或乙酸钠溶液调节至5.5[5]。 2.1.3.5 1mg/mL的木糖标准液
将木糖（D-木糖，C5H10O5 MW=150.3，上海惠世生化试剂有限公司）在恒温干燥箱中105℃下干燥至恒重，准确称取100mg于100mL小烧杯中，用少量乙酸－乙酸钠缓冲溶液（pH5.5）溶解并定容至100mL，充分混匀。4℃冰箱中保存（可用12～15天）[6]。
2.1.3.6 1％木聚糖标准溶液
精确称取1g木聚糖（Xylan from beechwood，Sigma）于100mL小烧杯中，加入乙酸－乙酸钠缓冲溶液（pH5.5），加热溶解后移入100mL容量瓶中并用乙酸－乙酸钠缓冲溶液定容至100mL，用前充分摇匀，4℃避光保存，有效期为3天[6]。 2.1.3.7 pH标准缓冲液
将pH6.86的缓冲剂（混合磷酸盐，上海雷磁·创益仪器仪表有限公司）和pH4.00的缓冲剂（邻苯二甲酸氢钾，上海雷磁·创益仪器仪表有限公司）分别剪开塑料袋，将粉末倒入250ml容量瓶中，以少量无CO2蒸馏水冲洗塑料袋内壁，并稀释到刻度，摇匀备用[7]。
2.1.3.7 不同pH的缓冲液配制
表2-1 pH不同的缓冲液配制
Tab. 2-1Preparation of the different buffer in pH
pH X Y pH X Y
4.0 7.71 12.29 6.0 12.63 7.37 4.4 8.82 11.18 6.4 13.85 6.15 4.8 9.86 10.14 6.8 15.45 4.55 5.2 10.72 9.28 7.2 17.39 2.61 5.6 11.60 8.40
0.2mol/L磷酸氢二钠溶液：称取Na2HPO4·12H2O（分子量＝358.14）71.63g溶解后，加水定容至1L。
0.1mol/L柠檬酸溶液：称取C6H8O7·H2O（分子量＝210.14）21.01g溶解后，加水定容至1L。
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按表2-1比例混合：Xml 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液＋Yml 0.1mol/L柠檬酸溶液。将X和Y混合后，置于三角瓶中，用pH计校正（可用磷酸氢二钠溶液或柠檬酸溶液调节）[7]。
2.1.3.8 不同pH的木糖标准溶液及木聚糖溶液配制
称取木糖0.02g，置于20mL具塞试管中，加入不同的pH缓冲液，溶解后，冷却并定容至20mL。
称取木聚糖0.1g，置于20mL具塞试管中，加入不同的pH缓冲液，加热溶解后，冷却并定容至10mL。
2.2 方法
2.2.1 木聚糖酶粗酶液制备
精确称取木耳菌糠，置于三角瓶中，加水100mL，并使三角瓶进行冰浴。将超声波破碎仪探头插入三角瓶，距离底部1cm处，按特定参数进行超声破碎。另称取一份，在105℃烘干4h，称重，计算干重与湿重比值。超声结束后，于4℃、3000r/min离心15min，取上清液即为木聚糖酶粗酶液[7]。
2.2.2 木聚糖酶活力测定方法
2.2.2.1 木糖标准曲线的绘制
取 8 支洗净、烘干的 20ml 刻度试管，编号后按下表加入木糖标准溶液和蒸馏水，配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液，具体见表2-2。
表2-2 木糖标准溶液的配制
Tab. 2-2 The standard xylose solution preparation
试 剂 标准木糖溶液（ml） 蒸馏水（ml） 木糖含量（mg）
管 号
1 0 2.0 0
2 0.2 1.8 0.2
3 0.4 1.6 0.4
4 0.6 1.4 0.6
5 0.8 1.2 0.8
6 1.0 1.0 1.0
7 1.2 0.8 1.2
8 1.4 0.6 1.4
将溶液摇匀后，向各试管中加入 1.5ml 3，5-二硝基水杨酸，摇匀后在沸水浴中加热 5min，取出冷却后用蒸馏水定容至刻度(要充分摇匀)。在波长 540nm处以 1 号试管溶液作为空白对照，调零点，测出其它各试管溶液的吸光度并记录结果。以木糖
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糖含量为横坐标、对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线[8]。 2.2.2.2木聚糖酶活力测定
取4支洗净烘干的20mL具塞刻度试管，编号后各加入1.5mL1％木聚糖溶液，并向1号试管中加入1.5mL DNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照，比色时调零用。
将4支试管同时在50℃水浴中预热10min，再各加入酶液0.5mL（预热10min），50℃水浴中保温60min后取出，立即向2、3、4号试管中各加入1.5mL DNS溶液以终止酶反应，充分摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至20mL，充分混匀。以1号试管溶液为空白对照调零点，在540nm波长下测定2、3、4号试管液的吸光值并记录结果。
酶活定义：1g木耳菌糠（干重）在50℃、pH5.5条件下，每分钟由水解木聚糖生成1μmol木糖所需的酶量定义为一个酶活力单位，以IU/g表示。
木糖含量（mg）× 酶液定容总体积（mL）×6.66 木聚糖酶活力 (IU/g)＝ 反应液中酶液加入量（mL）× 样品干重（g）× 时间（min） 式中：6.66为1mg木糖的μmol数。（1000/150.13=6.66）[9 ]
2.2.3 单因素试验
2.2.3.1 振幅（功率）对提取木聚糖酶的影响
准确称取木耳菌糠5份，超声波破碎的振幅分别设置为60%、70%、80%、90%、100%，固液比为1：40，超声时间为15s，总时间为15min，间歇时间为5s。破碎结束后，离心取上清液，并进行木聚糖酶活力测定，得出适宜振幅。 2.2.3.2 总时间对提取木聚糖酶的影响
准确称取木耳菌糠5份，超声波破碎的振幅设置为2.2.3.1中的最佳振幅，固液比为1：10，超声时间为15s，总时间分别为5、10、15、20、25min，间歇时间为5s。破碎结束后，离心取上清液，并进行木聚糖酶活力测定，得出适宜总时间。 2.2.3.3 超声时间对提取木聚糖酶的影响
准确称取木耳菌糠5份，超声波破碎的振幅设置为2.2.3.1中的最佳振幅，固液比为1：10，超声时间分别为5、10、15、20、25s，总时间为2.2.3.2得出的最佳时间，间歇时间为5s。破碎结束后，离心取上清液，并进行木聚糖酶活力测定，得出适宜超声时间。
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2.2.3.4 固液比对提取木聚糖酶的影响
准确称取木耳菌糠5份，超声波破碎的振幅设置为2.2.3.1中的最佳振幅，固液比分别为1：5、1：10、1：15、1：20、1：25，超声时间分别为2.2.3.3得出的最佳时间，总时间为2.2.3.2得出的最佳时间，间歇时间为5s。破碎结束后，离心取上清液，并进行木聚糖酶活力测定，得出适宜超声时间。
2.2.4 正交试验设计
在单因素试验的基础上，进行4因素（温度、时间、固液比）3水平正交试验，研究提取木耳菌糠中木聚糖酶的最佳工艺条件[10]。
表2-3 L9（34）正交表 Tab.2-3 L9 (34) orthogonal table
试验号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
A 1 1 1 2 2 2 3 3 3
B 1 2 3 1 2 3 1 2 3
C 1 2 3 2 3 1 3 1 2
D 1 2 3 3 1 2 2 3 1
2.3 作图及数据统计分析
作图及标准曲线拟合方程采用Microsoft Excel；试验数据采用DPS（Data Processing System）3.01专业版进行方差分析，用LSD法进行显著性测验[11]。
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