木耳菌糠木聚糖酶超声波提取工艺及部分酶学性质研究
3 结果与分析
3.1 单因素试验结果
3.1.1 振幅对提取木聚糖酶的影响 2.1木聚糖酶活力（IU/g）2.01.91.81.71.660p?%振幅900% 图1 振幅对提取木聚糖酶的影响
Fig.1 The affect of amplitude to extract xylanase
由图1可见，振幅在60%～80%时，随着振幅增大，超声波对细胞壁的破坏作用增强，胞内酶溶出速率增大，溶液中酶含量增大；振幅在80%～100%时，随着振幅增大酶的含量下降。其主要原因是当振幅大于80%时，超声作用进一步加强了提取液的流动，从而减少了物料在超声场中的停留时间破壁作用也随之减弱[12]。因此较适宜的振幅为80%。
3.1.2 总时间对提取木聚糖酶的影响 木聚糖酶活力（IU/g）1.81.71.61.51.41.3510152025总时间（min）图2 总时间对提取木聚糖酶的影响 Fig.2 The affect of total time to extract xylanase
由图2可知随着时间的增加，提取出的木聚糖酶越多。因为超声波破碎细胞结构使细胞内的酶释放出来，所以当时间增多，破碎效果好，释放酶就多，但是当继续延长时间时木聚糖酶的活力增加趋于平缓，这说明超声总时间对酶的提取量有着比较明
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显的影响，时间过短，酶的释放不充分，时间过长又起不到明显的增强作用，反而会浪费很多能量[13]。因此超声总时间选择20min为最佳。
3.1.3 超声时间对提取木聚糖酶的影响 2.5木聚糖酶活力（IU/g）2.42.32.22.12.01.91.851015超声时间（s）2025图3 超声对提取木聚糖酶的影响 Fig.3 The affect of Ultrasonic to extract xylanase
由分析图3可以看出，超声时间为10s时为最佳。在超声总时间一定的条件下，在5～10s时物料在超声场中的停留时间逐渐增大，对细胞的破坏越明显，释放出的酶越多。但在大于10s时，酶的活力降低，由于酶在超声波场中停留时间过长，可能在超声波的空化作用[13]下，产生的瞬间高温高压，导致酶的结构变化甚至被分解而使酶逐渐失活，所以活力降低。因此，最佳超声时间为15s。
3.1.4 固液比对提取木聚糖酶的影响 木聚糖酶活力（IU/g）3.53.02.52.01.51.00.51:51:101:15固液比1:201:25图4 固液比对提取木聚糖酶的影响 Fig.4 The affect of liquid-solid ratio to extract xylanase
由图4可以看出，不同的固液比对酶的提取有显著影响。随着固液比的增大，酶的活力越大。原因是提取液体积越大，接触越充分。在相同时间内溶解出更多的酶。但如果固液比过大，会消耗更多的的时间和能量同时也会增加超声波破碎细胞的阻力，使细胞破碎程度下降，从而降低有效成分的得率[14]。因此固液比为1：20为宜。
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3.2 正交试验结果与分析
表3-1木聚糖酶提取正交试验方案及结果分析
Tab.3-1 Xylanase extraction program and the results of orthogonal test
试验号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 K2 K3 R
振幅 （%） 60 60 60 70 70 70 80 80 80 2.87 3.13 2.87 0.26
总时间 （min） 15 20 25 15 20 25 15 20 25 2.34 3.23 3.31 0.97
超声时间 （s） 10 15 20 15 20 10 20 10 15 3.28 3.05 2.54 0.74
固液比 1：15 1：20 1：25 1：25 1：15 1：20 1：20 1：25 1：15 2.69 2.47 3.72 1.25
木聚糖酶活力（IU/g） 2.22 2.65 3.40 3.48 2.73 3.34 1.34 4.07 3.14
2.38 2.74 3.49 3.42 2.71 3.40 1.34 4.20 3.07
2.31 2.84 3.78 3.22 2.69 3.22 1.34 4.42 2.92
由正交分析表可知，极差：R固液比>R总时间>R超声时间>R振幅，所以固液比对木聚糖酶的提取的影响最显著，超声总时间的影响次之，超声时间的影响较弱，振幅的影响最弱。
表3-2木聚糖酶提取正交试验方差分析
Tab.3-1 Xylanase extract orthogonal analysis of variance
变异来源 振幅 总时间 超声时间 固液比 误差 总和
平方和 0.4214 5.19882 2.64702 8.05669 0.25233 16.57626
自由度 2 2 2 2 18
均方 0.2107 2.59941 1.32351 4.02834 0.01402
F值 15.03012 185.427 94.41162 287.3588
显著水平 0.00015 0.00000 0.00000 0.00000
由正交方差分析可知：振幅、总时间、超声时间、固液比的显著水平分析均小于0.01，所以它们对木聚糖酶的提取量均有极显著影响。
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表3-3 木聚糖酶提取试验显著性分析
Tab. 3-3 Extraction of xylanase significance analysis
试验号 8 3 4 6 9 2 5 1 7
木聚糖酶平均活力（IU/g）
4.23 3.56 3.37 3.32 3.04 2.74 2.71 2.30 1.34
显著性分析 0.05 a b bc c d e e f g
0.01 A B B BC C D D E F
经显著性分析，8号试验的木聚糖酶活最高，因为其在显著性分析中，在0.01水平上与其它各组实验均存在显著地差异性，且其平均酶活最大。表明8号试验工艺为木耳菌糠木聚糖酶提取的最佳工艺，即：振幅为80%；总时间为20min；超声时间为15s；固液比为1：25。
3.3 提取次数
木聚糖酶活力（IU/g）8.07.06.05.04.03.02.0123提取次数45 图5 提取次数 Fig.5 Extraction times
由图5知，在相同条件下，提取次数越多，酶浸提越完全。但随着提取次数的增多酶液的体积也增大，增加了后续处理的难度，所以提取次数不宜过多。此外，提取次数增多对能量的消耗也越多[15]。因此本实验中以4次为最佳提取次数。
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3.4 木聚糖酶酶学性质
3.3.1 pH对木聚糖酶活力的影响 木聚糖酶活力（IU/g）4.03.53.02.52.01.54.04.44.85.25.66.06.46.87.2pH 图6 pH对木聚糖酶活力的影响 Fig.6 The affect of pH to xylanase activity
由图6可知，在pH=4.8时为最佳。当超出这一范围时酶活力高低变化不稳，其原因是：一方面，可能与pH对酶蛋白活性部位中质子移变基团离子化状态的影响有关。酶活性部位中质子移变基团可能参与保持活性部位正确的构象，酶与底物的结合和底物转变成产物。在较高或较低的pH值范围内，pH值直接影响着该酶活性部位的正确构象，导致了该酶与底物物不能很好地结合，从而影响了底物被酶水解，最终使催化活力有不同程度地下降。另一方面，可能还与该酶对pH值的稳定性有关[16]。
3.3.2 温度对木聚糖酶活力的影响 木聚糖酶活力（IU/g）4.53.52.51.50.530405060708090温度（℃） 图7 温度对木聚糖酶活力的影响
Fig.7 The affect of Temperature to the xylanase activity
由图7可知，在50℃时酶的活力最高。原因是在较低的温度范围内，酶的活力随温度的升高而升高。在较高的温度条件下，温度的进一步提高，酶蛋白构象和参与酶促反应的官能团的离解状态、酶与底物、激活剂或抑制剂的亲和力等都要改变。在更高的温度条件下酶蛋白的构象要发生重大变化而发生热变性、即酶失活，而使酶的活力逐渐降低[16]。因此，酶的最适温度为50℃。
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