第一节 DNA的复制 一、DNA复制的一般特征
（一）半保留复制(semiconservative replication)
提取DNA密度梯度实验——实验结果支持半保留复制的设想
（二）有一定的复制起始点：DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即
复制起始点（复制子）。在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。
（三）需要引物（primer)：DNA聚合酶必须以一段具有3'端自由羟基（3'-OH）的RNA作为引物，才能开始聚合子
代DNA链。RNA引物的大小，在原核生物中通常为50～100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。
（四）双向复制：DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。但在低等生物中，也可进行单向复制。 (五)复制的半不连续性
领头链 ( leading strand )
顺着解链方向生成的子链，其复制是连续进行的，所得到一条连续片段的子链。 后随链与复制叉移动的方向相反，通过不连续的5ˊ-3ˊ聚合合成的新的DNA链 冈崎片段（ Okazaki fragment ） 在DNA不连续复制过程中，沿着后随链的模板链合成的新DNA片段。随后共价连接成完整的单链。其长度在真核与原核生物当中存在差别，真核冈崎片段长度约为100～200核苷酸残基，而原核为1000～2000核苷酸残基。 其他复制方式 滚环复制
（三）复制基本情况 1、复制起点（ori/O）有几十甚至几百个碱基的跨度
2、复制子（replicon）DNA复制时在复制的局部将链解开，形成复制单位，称为复制子。
一个复制子包括一个复制起始点
细菌和病毒：一个DNA分子就是一个复制子；真核生物：多个复制子(两个ori之间)
3 复制叉（replication fork）复制时DNA双链解开分成二股单链?新链沿着张开的二股单链生成，复制中
形成的这种 Y 字形的结构称为复制叉
4.复制的方向 双向复制（bidirectional replication） 原核生物例如E.coli 真核生物也是双向复制
单向复制（unidirection replication）
5、复制终点
环状DNA分子（原核生物）：双向复制的复制片段在复制的终止点（ ter ）处汇合（特异终止位点）。
简单随机碰撞（λ噬菌体）
线状DNA分子（真核生物） 串连体模型P107图
（四）DNA复制的酶学
? ? ? ?
底物（substrate) : dATP，dGTP，dCTP，dTTP；
聚合酶 (polymerase) : 依赖DNA的DNA聚合酶，简写为 DNA-pol ； 模板 (template) : 解开成单链的DNA母链； 引物 (primer) : 一小段RNA；
1、使DNA链解离的酶
（1）解旋酶 （ helicase ) 利用 ATP 供能，作用于氢键， 使DNA双链解开成为两条单链。
（2）单链DNA结合蛋白（SSB） 维持单链稳定 抑制RNA聚合酶
（3）DNA旋转酶（拓扑异构酶Ⅱ） 拓扑异构酶作用特点： 既能水解 、又能连接磷酸二酯键 拓扑异构酶Ⅰ 切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；
适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态（负超螺旋）
拓扑异构酶Ⅱ 切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛；
利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。
2、 DNA 聚合酶
聚合反应的特点：具有方向性，5 ? ? 3 ? ?
DNA 聚合酶不能催化两个游离的脱氧核苷酸聚合，只能在一段寡核苷酸的 3 ?- OH 逐个添加脱氧核苷酸，使核苷酸链不断延长。
（1）原核生物的DNA聚合酶： ?
DNA-pol Ⅰ1、5? ? 3? 的DNA聚合酶活性
2、3 ? ? 5 ? 外切酶活性 ：能辨认错配的碱基对，并将其水解 3、5 ?? 3 ? 外切酶活性：能切除突变的 DNA片段
? ?
DNA-pol Ⅱ
DNA-pol Ⅲ——在复制延长过程中?真正催化新链核苷酸聚合的酶
3、引物酶和引发体
引物酶 ( primase )依赖DNA的RNA聚合酶
在模板的复制起始部位催化NTP的聚合 , 形成短片段的RNA。这一小段RNA作为复制的引物（primer），提供 3?-OH末端，使DNA-pol能够催化dNTP聚合。
引发体（primosome） 引物酶与其他和复制有关的蛋白质形成的复合物。 4、DNA连接酶 ( DNA ligase )段相邻的DNA链连接成完整的链
DNA连接酶在DNA修复、重组、剪接中也起连接缺口的作用。 不能连接二份子单链DNA
连接DNA链3?- OH末端和相邻DNA链5?- P末端，使二者生成磷酸酯键 ，从而把两
(2)真核生物的DNA聚合酶
四)DNA的复制过程
原核生物的DNA复制：起始：起始方式：A，从头起
始 复制， D环复制，线状DNA的复制B，共价延伸 滚环复制
1在多种蛋白质参与下，DNA解开成单链，提供模板，引物合成
DnaA蛋白辨认起始点,形成起始复合物； DnaB（解旋酶）蛋白解螺旋 DnaC蛋白协助DnaB； SSB维持单链 形成复制叉
引物酶：合成一小段RNA，用来引导DNA聚合酶起始DNA链的合成。引物酶需引发前体护送才能催化引物合成
1、引物酶依据模板的碱基序列，从5'→3'方向催化NTP（注意不是dNTP）的聚合，生成的短链的RNA引物； 引发体：解螺旋酶，DnaC蛋白，引物酶和DNA复制其实区域得的复合结构
2、以合成的引物，必然留有3'-OH末端，
延长阶段
指在DNA-POL催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二脂蛋白的不断生成
前导链来说只要有一段RNA引物，DNA聚合酶就能
以此为起点，一直合成下去。 片段连在一起形成大分子DNA.。
后随链，，需要多种蛋白质和酶参与。引发体似火车头
一样在后随链分叉的方向前进，并在模板上断断续续的引发生成滞后链的引物RNA短链，再由DNA聚合酶 III 作用合成DNA，直至遇到下一个引物或冈崎片段为止。由RNA酶H降解RNA引物并由DNA聚合酶 I 将缺口补齐，再由DNA连接酶将每两个冈崎
复制的终止：
1去引物，填补缺口 2 连接冈崎片段
细菌环状染色体的复制通常为双向复制，两个复制叉在终止区相遇并停止复制，终止为含有多个终止子微点的区域
复制过程终止，复制也随之解体，拓扑异构酶Ⅵ负
责解开环连体，由RNA酶H降解RNA引物并由DNA聚合酶 I 将缺口补齐，再由DNA连接酶将每两个冈崎 ,复制完成。
真核生物的DNA复制
特点1. ①多复制起点但真核DNA比远比原核DNA大， 2.DNA复制必须受细胞周期的指挥
3.DNA复制完毕必须与组蛋白等一起组装成染色体等大分子结构
真核生物中，染色体DNA的复制仅发生在细胞周期的S期。这种保守的机制被称为“准许机
制”(licensing mechanisms)。
复制起始——真核细胞前复制复合体的形成
G1期，参与复制的有关因子首先对复制复制起点进行识别，在每个复制起点上组装形成一个蛋白复合体。
细胞进入S期后与复制起点结合的蛋白复合体启动DNA的解旋和DNA聚合酶的募集（但原核细胞中蛋白因子对复制起
点的识别和DNA解旋及聚合酶的募集相耦联），真核细胞的这两个过程被短暂分离保证了在每个细胞周期中每条染色体仅复制一次。
S期的起始时间的控制是由前复制复合物（Pre-replication complexes, Pre-Rc)在复制起始点的组装决定的。
首先，ORC识别复制起点。ORC由6个蛋白质组成的复合物，在细胞周期的所有阶段都在复制起始点位置，它是Pre-Rc
复合物组装的平台
ORC结合后募集两个解旋酶装载蛋白Cdc6和Cdtl（解除复制起始抑制因子geminin的作用）。
Cdc6为短命蛋白(半衰期﹤5min)。它在G1晚期合成并跨过G1期，并在有丝分裂结束与G1晚期时间与ORC结合。它快速降解使
以后的细胞循环中不能获得此蛋白质。Cdc6与ORC结合形成起始复合物。Cdc6此时起保护位于B1上的Dnase敏感位点。
ORC和装载蛋白共同募集Mcm2-7复合体（可能具有解旋酶活性），形成pre-RC。
细胞进入S期后，pre-RC被蛋白激酶Cdk（cylcin -dependent protein kinase）和Ddk（Cdc7/Dbf4）激活，使复制得以启动。而蛋白激酶只有
在细胞从G1期进入S期后才能被激活。活化的激酶可激活pre-RC和其他复制蛋白，导致它们在起始位点上的组装及复制起始。包括3种DNA聚合酶及其募集所需的其他蛋白质。
聚合酶在起始位点的组装是以DNA聚合酶δ和?先结合，聚合酶?后结合的顺序进行，然后才合成第一个RNA引物
由于Cdc6在S期被快速降解，它不能再次负载Mcm与复合物结合，所以复制起点在S期不能被再次起始。
虽然G2期ORC仍结合于ori，但由于无Cdc6和Mcm，复制不能起始。 细胞周期控制着Cdc6的合成，而Cdc6又控制着复制。
端粒位于真核生物染色体DNA的3’末端，由独特的DNA重复序列及相关蛋白组成的复合体。
端粒的功能：
①维持染色体的完整性，决定细胞的寿命。若无端粒，两个染色体末端很可能融合一起。 ②解决末端复制问题。端粒酶能与端粒作用，延伸其长度。
产生端粒问题的原因是DAN复制需要引物，而RNA引物最终被降解，可能导致线状DNA端部不断变短，信
息丢失。
端粒酶的作用机制：端粒酶的RNA分子与端粒DNA配对，以RNA为模板进行类似逆转录合成DNA，向5’
→3’延伸端粒至模板RNA末端后，延长的DNA末端与RNA模板解离，端粒酶移动，重新定位于延长后的DNA3’端，开始下一轮延长过程，如此反复可达数百次合成几百个或数千个重复序列。
引物酶及DNA pol按合成滞后链方式延伸另一链。虽然滞后链仍比模板链短，但整个DNA已被加长。可避免DNA随复制而逐渐变短。
最后以延长的DNA链为模板,由引物酶-DNA聚合酶合成富含G的另一条链,完成端粒的复制
过程 DNA双螺旋的解旋 单链结合蛋白（SSB） DNA拓扑异构酶（DNA topoisomerase） DNA解链酶（DNA helicase） 酶或蛋白 作用 原核生物 酶或蛋白 作用 真核生物 水解ATP获得能量来解开双链DNA，大部分可沿后随链模板5’→3’方向随复制叉前进而移动，Rep蛋白是沿前导链模板的3’→5’方向。 保持单链的存在，无解链作用。原核生物SSB蛋白与DNA结合表现出协同效应。 消除解链造成的正超螺旋的堆积，消除阻碍解链继续进行的这种压力，使复制得以延伸。