IV. 分子伴侣（molecular chaperone）
2、 能够在细胞内辅助新生肽链正确折叠的蛋白质。是一类序列上没有相关性但有共同功能的保守性蛋白质。 按是否自发性折叠分为：热休克蛋白和伴侣素。 4、信号肽假说：信号肽假说内容： （1）蛋白质合成起始首先合成信号肽
（2）SRP（信号识别蛋白）与信号肽结合，翻译暂停 （3）SRP与SRP受体结合，核糖体与膜结合，翻译重新开始 （4）信号肽进入膜结构
（5）蛋白质过膜，信号肽被切除，翻译继续进行 （6）蛋白质完全过膜，核糖体解离
●信号肽： 常指新合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移的N-末端氨基酸序列（有时不一定在N端）。 3、蛋白质转运机制： 蛋白性质 运转机制 主要类型 分泌 蛋白质在结合核糖体上合成，并以翻译-免疫球蛋白、卵蛋白、水解酶、激素等 运转同步机制运输 细胞器发育 蛋白质在游离核糖体上合成，以翻译后核、叶绿体、线粒体、乙醛酸循环体、过氧运转机制运输 化物酶体等细胞器中的蛋白质 膜的形成 两种机制兼有 质膜、内质网、类囊体中的蛋白质 5、蛋白质降解中泛素的参与：蛋白质的降解依赖于泛素（ubiquitin，Ub）。
泛素由７６个高度保守的氨基酸组成，普遍存在于真核生物中，故名泛素。它最初是从小牛的胰脏中分离出来的。 共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径。26S蛋白酶体是一个大型的蛋白酶，可将泛素化的蛋白质分解成短肽。
泛素相当于蛋白质被摧毁的标签，被贴上标签的蛋白质就会被运送到细胞内的―垃圾处理厂‖，在那里被降解。 降解涉及到的三种重要酶：E1,E2,E3的作用：
? E1激活泛素分子，
? E2就负责把泛素分子绑在被降解蛋白质上。 ? E3能识别被降解的蛋白质。
7、核糖体循环步骤：核糖体循环包括多肽链合成的进位、转肽、脱落和移位三步反应。
第五章分子生物学的研究方法（上）
编辑：朱孟凯
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1.基因操作：主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工合成、定点突变和PCR扩增等。
基因工程：指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入新的宿主细胞内并获得持续稳定增值能力和表达。
基因工程技术实际上是核酸操作技术的一部分。
重组DNA技术-基因工程流程 1.分—载体和目的基因的分离 2.切—限制性内切酶的应用
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3.接—载体与目的基因连接成重组体 4.转—基因序列转入细胞
5.筛—目的基因序列克隆的筛选和鉴定 6.表－目的基因在宿主细胞的表达 限制性内切酶切割方式有两种
1）、错位切割，产生互补性的粘性末端。
错位切割所产生的DNA末端，两条链不平齐，一条链凸出，一条链凹进，这种末端称为黏性末端。带有相同黏性末端的DNA分子很容易在末端互补配对，连接成新的重组分子。 2）、 沿对称轴切割，产生平齐末端 基因库，也叫基因组文库， DNA文库（ DNA library)
是指用克隆的方法将一种生物的全部基因组长期以重组体方式保持在适当的宿主中。
将生物细胞基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA片段随机地同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA的所有序列。这样保存的基因组是多拷贝、多片段，当需要某一片段时，可以在这样的―图书馆‖中查找（没有目录）。 cDNA文库
首先获得mRNA，反转录得cDNA，经克隆后形成文库。
cDAN文库和基因组文库的不同之处在于，cDNA文库除却了mRNA拼接过程中除去的内含子等成分，便于DNA重组的使用。其复杂性比基因文库低得多。
主要用于研究蛋白质的氨基酸顺序，可根据克隆的cDNA分子的核酸序列直接推倒出来。
分子杂交： 是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上,然后用标记的探针与被固定的分子杂交,经显影后显示出目的分子所处的位置的过程.
分子杂交包括：DNA-DNA杂交（原位杂交、点杂交、Southern杂交），DNA-RNA杂交（Northern杂交）及蛋白杂交（Western 杂交）等。
Southern杂交用途： 用来检查DNA样品中是否存在有某个特定的基因，而且还可知道其大小及酶切位点的分布。 Northern RNA 印迹杂交用途：用来检查基因组中某个特定的基因是否得到转录 。 聚合酶链式反应（PCR）
体外酶促合成特异DNA片段的新方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成 .
SNP 单核苷酸多态性single nucleotide polymorphism指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性. 只涉及到单个碱基的变异(转换或颠换)，也可由碱基的插入或缺失所致。 环形双链质粒DNA分子具有三种不同构型：
共价闭合环状的SC构型DNA（cccDNA），开环的OC构型DNA（ocDNA）， 线性的L构型DNA （LDNA），
三者具有不同的电泳迁移率，可在琼脂糖凝胶电泳中分开。共价闭环>线状>开环 蓝白斑筛选出阳性菌落:
Lac Z‘ 半乳糖苷酶基因，在含Xgal培养基上呈蓝色，插入外源DNA，重组子培养呈白色
pUC质粒，可插入外源基因片段长度约10kb。将外源基因插入到MCS中，随质粒的表达而表达，增殖而扩增。外源基因插入到MCS后，β-半乳糖苷酶的活性丧失而不显兰色菌落。如果不插入外源基因，则产生兰色。从而筛选阳性菌落。
第七章
基因表达的方式
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组成性基因表达
适应性表达（诱导和阻遏表达）
1、组成性基因表达
某些基因在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为管家基因 (house-keeping gene)。
无论表达水平高低，管家基因较少受环境因素影响，而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。区别于其他基因，这类基因表达被视为组成性表达。
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2、调节蛋白
操纵子(operon)包括俩个区
控制区：1）调节基因（Regulatory gene）——为阻抑蛋白编码基因
2）启动基因（Promoter）——为cAMP受体蛋白（CRP）和RNA聚合酶结合区。
3） 操纵基因（0perater）——为阻抑蛋白结合位点。 信息区——由一个或数个结构基因串联在一起组成。
由操纵基因以及相邻的若干结构基因所组成的功能单位，其中结构基因转录受操纵基因所控制。 ?
操纵基因是顺式控制元件，阻抑蛋白是反式作用因子
真核生物的顺式作用元件
是指可影响自身基因表达活性的特异DNA 序列。通常是非编码序列。包括启动子、增强子及沉默子等。 2、调节蛋白
是调节基因转录的蛋白因子，如原核生物的阻遏蛋白和CAP蛋白（降解物基因活化蛋白）、真核生物的基本转录因子和特异转录因子等。
原核基因调控机制的类型与特点 （一） 原核基因调控机制的类型 1、负调控 negative regulation
在没有调节蛋白质存在时基因是表达的，加入某种调节蛋白质后基因活性就被关闭，这样的控制系统就叫做负控系统 。
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其调节蛋白质叫做阻遏蛋白 两种类型：负控诱导和负控阻遏
在没有调节蛋白质存在时基因是关闭的，加入某种调节蛋白质后基因活性就被开启，这样的控制系统就叫做正控系统。
其调节蛋白质叫做无辅基诱导蛋白（激活蛋白) 两种类型:正控诱导和正控阻遏系统
2、正调控 positive regulation
（二）特殊代谢物调节基因表达的类型 1、可诱导调节
? 一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活
化.
? 调节分解代谢的操纵子，同时受cAMP-CAP的活性调节 2、可阻遏调节
? 一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来开启的状态转变为关闭状态，基因的表达被阻遏. ? 调节合成代谢的操纵子 （三）原核生物基因表达调控的特点
? 调节的主要环节在转录水平上进行 ? ζ因子决定RNA聚合酶识别特异性 ? 主要通过操纵子模式进行调节
? 阻遏蛋白对转录的抑制作用（阻遏机制）是普遍存在的负调控作用 原核生物中基因的组织形式
? 几个作用相关的基因在染色体上串连排列在一起，由同一个调控系统来控制。
? 这样的一个整体称为一个操纵元(operon)。 大肠杆菌至少有6种ζ因子 ζ70：负责识别一般的启动子 ζ54：识别与氮代谢有关的基因启动子
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ζ32：识别热激（heat shock）蛋白质基因启动子
。 2、细菌的应急反应的机制：应急信号： 鸟苷四磷酸（ppGpp）、 鸟苷五磷酸（pppGpp）
? 诱导物：空载tRNA
乳糖操纵子与负控诱导系统：乳糖操纵子(lac operon)的结构与组成 酶的诱导-lac体系受调控的证据 1、实验证据
? 在不含乳糖及β-半乳糖苷的培养基中，lac+基因型每个大肠杆菌细胞内大约只有1～2个酶分子。
? 如果在培养基中加入乳糖，酶的浓度很快达到细胞总蛋白量的6%或7%，每个细胞中可有超过105个酶分子 2、实验用诱导物
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乳糖
IPTG(异丙基巯基半乳糖苷) TMG(巯甲基半乳糖苷) ONPG(O-硝基半乳糖苷)
乳糖操纵子模型
1、Z、Y、A基因的产物为一条多顺反子mRNA
lacZ：编码β-半乳糖苷酶，它可以将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖； lacY：编码半乳糖苷透性酶，它能将乳糖运送透过细菌的细胞壁； lacA：编码硫代半乳糖苷乙酰转移酶，进行乳糖代谢。
2、P区位于I与O之间，O为阻遏物结合位点：阻遏物与O区的结合影响了RNA聚合酶与启动子区结合形成转录起始复合物的效率。
4、 CAP的正性调节：ATP在腺苷酸环化酶的作用下转变成环式
? Catabolite activating protein, CAP ? 代谢激活蛋白，是cAmp的受体蛋白 (cyclic Amp receptor protein, CRP)
? cAmp-CAP复合物，是lac操纵元的正调控因子 ? 无葡萄糖时camp浓度高，反之则低。 5、 协调调节
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当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用； 如无CAP存在，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子 仍无转录活性。
单纯乳糖存在时，细菌利用乳糖作碳源；
若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖
lac操纵子的本底水平表达
因为诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而运转诱导物需要透过酶。
在非诱导状态下有少量（1-5个mRNA分子）lac mRNA合成--本底水平组成型合成。 3、阻遏物lacI基因产物及功能 4、葡萄糖对lac操纵子的影响
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葡萄糖 腺苷酸环化酶活性降低 ATP 无法转变成 cAMP 不能形成 CAP-cAMP 复合蛋白 RNA 酶无法结合在 DNA 上 结构基因不表达。 代谢物阻遏效应
研究认为葡萄糖的某些降解产物抑制lac mRNA的合成，这种效应称之为代谢物阻遏效应.
5、cAMP与代谢物激活蛋白
cAMP-CRP复合物与启动子区的结合lac mRNA合成起始所必需的，有利于形成稳定的开放型启动子-RNA聚合酶结构。 lac基因产物数量上的比较
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Z、Y、A三个基因产物的拷贝数比例为1：0.5：0.2
1、Lac mRNA可能在翻译过程中的核糖体相脱离，从而终止蛋白质链的翻译。
2、Lac mRNA分子内部，A基因比Z基因更易受内切酶作用发生降解，故Z基因的完整拷贝数要比A基因多。
原因：在翻译水平上的调节
（三）操纵子的融合与基因工程
操纵子的融合：由较弱启动子和强启动子的基因形成的融合基因，可以通过强启动子使弱启动子的转录增强，增加蛋白表达量。
四．色氨酸操纵子与负控阻遏系统 特殊代谢物调节基因活性的类型
? 可诱导调节：调节分解代谢的操纵子，同时受cAMP-CAP的活性调节 ? 可阻遏调节：调节合成代谢的操纵子
阻遏型操纵子：辅阻遏蛋白无活性，不能与操纵基因结合，结构基因表达.
? 色氨酸操纵子主要参与调控一系列用于色氨酸合成代谢的酶蛋白的转录合成。当细胞内缺乏色氨酸时，此操纵子开
放，而当细胞内合成的色氨酸过多时，此操纵子被关闭。
? 色氨酸操纵子的调控机制与乳糖操纵子类似，但通常情况下，操纵子处于开放状态，其辅阻遏蛋白不能与操纵基因
结合而阻遏转录。
? 而当色氨酸合成过多时，色氨酸作为辅阻遏物与辅阻遏蛋白结合而形成阻遏蛋白，后者与操纵基因结合而使基因转
录关闭。
弱化子与前导肽
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三）mRNA前导区的序列分析
前导区mRNA上有两个连续的色氨酸密码子；前导序列上有4个分别以1、2、3、4表示的片断能以两种不同的方式进行碱基配对，有时以1－2和3－4配对，有时只以2－3方式互补配对.
? 提高效率。
二、稀有密码子对翻译的影响
? 实验证据
RNA引物由dnaG基因编码的引物酶催化合成
dnaG、rpoD及rpsU属于大肠杆菌基因组上的同一个操纵子
基因转录出来的三个蛋白相应的mRNA拷贝数大体相同，由于翻译的调控使得蛋白的拷贝数发生了很大的变化。 由于细胞内对应于稀有密码子的tRNA较少，高频率使用这些密码子的基因翻译过程容易受阻，影响了蛋白质合成的总量。
三、重叠基因对翻译的影响
? 重叠基因对翻译的影响
? 重叠的密码保证了同一核糖体对两个连续基因进行翻译的机制。 ? 偶联翻译是保证两个基因产物在数量上相等的重要手段。 六、魔斑核苷酸水平对翻译的影响
空载氨酰-tRNA对蛋白质和RNA的合成速度进行调控 （一）严紧控制和松散控制 1、严紧控制（基因型rel＋）
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当细菌处于饥饿条件下，缺乏维持蛋白质合成的氨基酸，其大部分活性区域将被关闭，此称之为严紧控制。 严紧控制导致两种特殊的核苷酸积累：PPGpp、pppGpp
在操纵区与结构基因之间的一段可以终止转录作用的核苷酸序列，当操纵子被阻遏时，RNA合成被终止，这段核苷酸起终止转录信号作用. 起调节作用的是某种氨酰-tRNA的浓度
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