延伸，无3-5外切酶活性。广泛用于mRNA为模板合成cDNA，构建cDNA文库。
（3）T4DNA连接酶：催化双链DNA一端3-OH与另一双链DNA的5端磷酸根形成3、5-磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平端的DNA末端连接起来。
（4）碱性磷酸酶：去除DNA或RNA 5 端的磷酸根，制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身连接，提高重组效率。
（5）末端脱氧核苷酰转移酶：（TdT）：将脱氧核苷酸加到DNA的3-OH上，主要用于探针标记；或者在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接。 （6）TaqDNA聚合酶和其它耐热DNA聚合酶。 38 作为克隆载体的质粒具备以下特点：
（1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。（2）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主细胞进行选择，（3）具有多个限制酶的单一切点，称为多克隆位点（MCS）。 39 粘性质粒的特点：（1）含有质粒的抗药性标记（2）带有入噬菌体的粘性末端（cos区）；（3）具有一个或多个限制酶的酶切位点；（4）其本身分子量小，容纳40kb左右的DNA片段；（5）由于非重组粘性质粒很小，不能在体外包装，因而体外包装的主要是重组体，有利于以后的筛选。 40 M31噬菌体的优点：（1）噬菌体颗粒中所含有的是单链DNA，该单链DNA可作为模板用于DNA序列分析；（2）利用单链M13克隆可制备成单链DNA探针用于杂交分析，检测DNA或RNA，或者作为基因定点诱变的载体。
41大肠杆菌与哺乳动物表达载体的不同：
大肠杆菌：含有复制位点、抗性基因、克隆位点，可导入大肠杆菌，与克隆载体一样，表达载体中含有表达系统元件，即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。 哺乳动物：真核表达载体中含有一套真核表达元件：；启动子/增强子-克隆位点-终止信号和加poly(A)信号。 42 重组DNA的目的和基本过程： 目的：（1）克隆某个特定的基因；（2）建立基因文库、cDNA文库，（3）将特定的基因片段进行亚克隆以进行DNA序列测定；（4）构建表达载体以便在特定的宿主细胞中表达某个基因。 过程：（1）制备目的基因和相关载体（2）将目的基因和有关载体进行连接（3）将重组的DNA导入受体细胞（4）DNA重组体的筛选和鉴定（5）DNA重组体的扩增、表达和其它研究。
43 cＤＮＡ的合成过程：先从细胞中提取高质量的mＲＮＡ。因mＲＮA有poly(A)尾巴，可用12~18寡聚d(T)片段作为引物，加入4种dNTP,AMV(或MMLV)逆转录酶催化第一股链的合成。然后用RNaseH去掉mRNA，剩下的单链DNA的3端往往有自发回折（原因不明）形成的发夹结构，正好可以作为合成第二条DNA链的引物；由T4DNA聚合酶催化第二股链的合成，即得到双链cDNA的混合体，采用S1核酸酶处理，可得到平端的双链cDNA。 44 目的基因的筛选与鉴定：
首先筛选出转化菌；然后筛选出带有重组体的克隆；最后是对DNA重组体进行鉴定。方法：遗传学方法（插入灭活法、a-互补）；免疫学方法；核酸杂交法；PCR技术；酶切鉴定。 45 真核细胞转染的基本方法：（1）磷酸钙共沉淀法（2）电穿孔法（3）DEAE-葡萄糖法（4）脂质体介导基因导入（5）显微注射法
46 在大肠杆菌中表达外源基因，主要考虑以下基本要素：
（1）目的基因如果来自真核细胞必须是cDNA，因为大肠杆菌没有剪切内含子的功能。（2）从真核基因转录的mRNA缺乏结合细菌核糖体的SD序列，因此，cDNA的起始密码子（ATG）上游部分（5端非编码区）是无用的，必须除去。（3）所用表达载体必须是大肠杆菌表达载体。含有大肠杆菌RNA聚合酶所能识别的启动子和SD序列。
47 寡核苷酸介导的诱变技术步骤：
（1）将目的DNA片段插入M13噬菌体载体；（2）以重组噬菌体制备单链DNA；（3）设计并合成诱变寡核苷酸引物；（4）诱变寡核苷酸引物与靶单链DNA杂交；（5）利用Klenow片段在杂交的寡核苷酸上延伸；（6）用T4DNA连接酶将新合成的杂合双链DNA连接成双链闭环DNA分子；（7）转化宿主细菌；（8）
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筛选含有诱变DNA片段的重组噬菌体；（9）以含有诱变DNA的重组噬菌体制备单链DNA；（10）测序证实M13噬菌体DNA带有目标诱变而无其它诱变。最后从重组M13噬菌体RF型DNA中回收诱变的DNA片段，克隆到其它适当的载体中，对诱变DNA片段进行进一步研究。
48 双脱氧链终止法基本原理：和模板互补结合的引物在DNA聚合酶作用下发生互补链的延伸反应，反应体系中的2，3-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）与底物脱氧核苷三磷酸竞争结合于延伸互补链末端，造成延伸终止。由于产生一系列分别终止于A、G、C、T位置的不同大小的DNA片段，应用高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳可分辨仅相差一个核苷酸的20-500碱基的DNA片段，结合放射自显影技术，便能直接读出模板DNA的待测序列。双脱氧终止法测定DNA序列的片段通常克隆于M13或质粒pUC载体，利用多克隆位点两侧的通用引物进行测序反应。较长链的待测DNA片段可采用随机法、嵌套缺失法和引物延伸法进行序列测定。
Maxam-Gilbert法基本原理：采用化学试剂处理末端放射标记的DNＡ单链片段，造成碱基特异性切割，由此产生一组具不同长度的ＤＮＡ链的反应混合物，经凝胶电泳按分子大小分离和放射自显影，直接读出待测ＤＮＡ的核苷酸顺序。
激光测序技术：应用荧光基团标记引物或４种ddＮＴＰ，采用双脱氧链终止法原理进行测序反应，双脱氧核苷酸终止产物经荧光激发产生信号，通过计算机自动读出被测序列。 ４９ 温度对ＤＮＡ复性（杂交）的影响：
温度过高不利于核酸复性，而温度过低，少数碱基配对形成的局部双链不易解离，适宜的复性温度是较Ｔm值低２５℃。在０度时杂交进行非常缓慢，随着温度的升高，杂交率也明显增加，当温度比Ｔm值低２０－２５度时，ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交达到最高杂交率。但在更高温度情况下，双链分子逐渐趋向解链，当温度达到Ｔm－５度时杂交率即非常低。（１）错配率第增加１％，Ｔm值应相应下降１０－１５度；（２）ＲＮＡ／ＤＮＡ杂交体的稳定性较ＤＮＡ／ＤＮＡ的稳定性高，Ｔm值应相应增加１０－１５度；（３）ＲＮＡ／ＲＮＡ杂交体的Ｔm值应相应增加２０－２５度，因此，采用ＲＮＡ探针时，加入适量的甲酰胺以降低Ｔm值是必需的；（４）寡核苷酸探针的碱基数很少，可以采用下式计算寡核苷酸探针Ｔm值：Ｔm=4*(G+C)+2*(A+T)；寡核苷酸探针杂交反应一般在低于Ｔm值５度下进行。 ５０ 常用的Ｓouthern转膜方法：（１）毛细管虹吸印迹法：（２）电转印法（３）真空转移法 ５１ Ｓouthern\\Northern印迹法区别：
（１） 靶核酸：Ｎ所检测的靶核酸是ＲＮＡ，Ｓ是ＤＮＡ（２）ＲＮＡ电泳：ＲＮＡ样品依其分子量大
小在变性胶中进行分离，凝胶中需加入变性剂，防止ＲＮＡ分子形成二级结构，维持其单链线性状态。（３）转膜：电泳结束后，不需要再进行变性和中和，直接采用毛细管虹吸法将胶中的ＲＮＡ转移到膜上，也可采用电转移或真空转移法。
５２ 核酸原位杂交步骤：（１）组织或细胞的固定（２）组织细胞杂交前的预处理（３）探针的选择和标记（４）杂交（５）杂交结果检测。
５３ ＲＮＡ酶保护分析法（ＲＰＡ）基本程序步骤：（１）制备待测ＲＮＡ（２）ＲＮＡ探针的标记（３）杂交（４）除去单链ＲＮＡ（５）电泳分析 ５４ 探针及标记物的种类：
探针（１）cＤＮＡ探针（２）基因组ＤＮＡ探针（３）寡核苷酸探针（４）ＲＮＡ探针。 标记物：（１）核素标记物（２）非核素标记物：半抗原、配体、荧光素、化学发光探针。 ５５核酸体外标记法分为化学法和酶法：（１）化学法：利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团（如磷酸基团）发生的化学反应将标记物直接结合到探针分子上。（２）酶法（酶促标记法）：将标记物预先标记在核酸苷酸（ＮＴＰ或dＮＴＰ）分子上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子掺入到探针分子中去，或将核苷酸分子上的标记基团交换到探针分子上。 ５６ 酶促标记法：（１）缺口平移法；（２）随机引物法（３）ＰＣＲ标记法（４）末端标记法
５７缺口平移法原理：利用适当浓度的ＤＮaseＩ在ＤＮＡ双链上随机切割单链，造成单链切口。切口处产生一个５末端和一个３末端，３末端即可作为引物，在大肠杆菌ＤＮＡ聚合酶Ｉ的５－３ＤＮＡ聚合酶活性的催化下，以互补的ＤＮＡ单链为模板，依次将dNTP连接到切口的３端羟基上，合成新的ＤＮＡ单链；
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同时ＤＮＡ聚合酶Ｉ的５－３核酸外切酶活性在切口处将旧链人５末端逐步切除，新合成链不断延伸，从而使原ＤＮＡ分子上的部分核苷酸残基被标记的核苷酸所取代。 ５８ ＰＣＲ基本过程：（１）变性：通过加热至９５度左右，使ＤＮＡ双螺旋的氢键断裂，形成单链ＤＮＡ，作为反应的模板。（２）退火：将温度降至引物的Ｔm值左右或以下，引物与ＤＮＡ模板互补区域结合，形成杂交链。（３）延伸：当反应体系温度升至７０度左右时，ＴaqDNA聚合酶催化以引物为起始点的５－３ＤＮＡ链延伸反应，形成新生ＤＮＡ链。 ５９ ＰＣＲ引物设计的基本要求：（１）引物长度一般为１５－３０个核苷酸。（２）引物中的碱基组成尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象。（３）引物自身不应存在互补序列，尤其应避免折叠成发夹结构。（４）两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免３端的互补重叠。（５）引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过７０％，引物３末端连续８个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增（６）引物３端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板ＤＮＡ配对（７）引物与模板结合时，引物的５端最多可以游离十几个碱基而不影响ＰＣＲ反应的进行。 ６０ＰＣＲ技术的要类型：（１）筑巢ＰＣＲ（２）共享引物ＰＣＲ（３）多重ＰＣＲ（４）不对称ＰＣＲ（５）锚定ＰＣＲ（６）反向ＰＣＲ（７）彩色ＰＣＲ（８）原位ＰＣＲ（９）定量ＰＣＲ（１０）差异显示ＰＣＲ（１１）重组ＰＣＲ。
６１ ＰＣＲ反应体系包括：核酸模板、引物、ＴaqＤＮＡ聚合酶、缓冲液、Ｍg2+、dＮＴＰs、反应温度与循环次数。
６２ 转基因动物及基本原理：转基因动物是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。基本原理：将目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因整合到基因组中，然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动物园的输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物。导入基因的方法有显微注射法、胚胎干细胞法、逆转录病毒感染法、精子载体法。 转基因动物中外源ＤＮＡ的检测：（１）染色体及基因水平的检测：斑点杂交、Ｓouthern杂交和ＰＣＲ分析、原位杂交等；（２）转录水平的检测：利用Northern杂交、RNase保护分析及ＲＴ－ＰＣＲ方法检测转基因mRNA的存在及表达水平。（３）蛋白质水平检测，采用Western印迹分析法。 ６３ 转基因动物的应用：（１）对基因组织或阶段特异表达的研究（２）通过研究转入外源基因后的新表型，可以发现基因的新功能；（３）导入外源基因后，由于基因的随机插入，可能会导致内源基因的突变，对这些突变表型进行分析，可以发现新的基因（４）可用于只在胚胎期才表达的基因的结构和功能的研究（５）建立研究外源基因表达、调控的动物模型（６）对遗传性疾病的研究（７）建立人类疾病的动物模型，（８）动物新品种的培育（９）基因产品的制备（１０）在免疫学中，可用于对免疫机制、免疫相关疾病的研究及建立免疫性疾病动物模型等。 ６４ 转基因植物技术路线：（１）选择及获得外源目的基因，（２）受体细胞培养，（３）选用适当的转基因方法将目的基因导入受体细胞（４）将转化细胞进行适当培养（５）筛选阳性转化细胞（６）培植阳性转化植株（７）转基因植株的鉴定。 ６５转基因植物在医学上的应用：（１）可成为新的疫苗来源，植物病毒也成为人类疫苗的可能来源（２）因为植物病毒对动物不致病，因此可利用植物病毒表达抗原蛋白的片段，以诱导哺乳动物免疫系统发生反应。（３）还可产生单抗，作为化疗药物的靶向载体。 ６６基因打靶的必备条件：（１）胚胎干细胞：ＥＳ细胞的特点：能在体外培养，并保留发育的全能性。体外培养要维持细胞的分裂增殖与正常的核型，同时抑制细胞的分化。（２）打靶载体：a、neo阳性筛选标志：b、ＨＳＶ－tk阴性筛选标志： ６７ 构建打靶载体的基本过程：（１）获得目的基因（待敲除基因）的同源片段，将此ＤＮＡ片段克隆到一般的质粒载体中；（２）从重组质粒中切除目的基因的大部分同源ＤＮＡ序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端；（３）将neo基因克隆到带有目的基因同源顺序的线性质粒中，使之位于残留目的基因同源顺序的中间；（４）在目的基因同源顺序的外侧线性化重组质粒载体，将ＨＳＶ－tk基因克隆到此线性载体中。
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６８ ＤＮＡ芯片技术的应用：（１）ＤＮＡ序列测定（２）基因表达分析（３）基因组研究（４）基因诊断（５）药物研究与开发（药物筛选、新药发现、合理用药、中草药鉴定和真假药辨别） ６９引起ＤＮＡ一级结构变异的诱变剂的作用机制：（１）碱基类似物诱发突变（２）改变ＤＮＡ的化学结构（３）结合到ＤＮＡ分子上诱发移码突变（４）紫外线及其其它射线引起的ＤＮＡ分子变化。 ７０ 突变类型：点突变（转换和颠换）、缺失（一个碱基或一段核苷酸链从ＤＮＡ大分子上消失）、插入（一个原来没有的碱基或一段原来没有的核苷酸链插入ＤＮＡ大分子中间）、倒位（ＤＮＡ链内重组，使其中一段方向反置）
７１ 突变所引起的遗传效应包括：（１）遗传密码的改变：错义突变、无义突变、同义突变、移码突变；（２）对mRNA剪接的影响（3）蛋白质肽链中的片段缺失。 72病毒癌基因与细胞癌基因的不同之处：
（１） 病毒癌基因与细胞癌基因相比，通常丢失了两端的某些序列。（2）病毒癌基因没有内含子，而细
胞癌基因中通常含有内含子或插入序列。（3）病毒癌基因与同源的细胞原癌基因在外显子序列中也有微小的差别。（4）病毒癌基因常会出现碱基取代或碱基缺失等突变，而细胞癌基因则较少发现这一类突变。
73癌基因家族：src\\ras\\myc\\sis\\erb\\myb.
74 RB抑癌基因机制：RB蛋白在静止细胞中与E2F结合成复合物，抑制E2F的转录活性；P105-RB通过抑制多种原癌基因如c-myc\\c-fos的表达而抑制细胞增殖。 75 P53抑制细胞生长机制：（1）P53蛋白可抑制cyclinA的表达，故P53基因的变异或缺失，可使cyclinA过量表达而促进细胞在DNA复制不完全时即进入M期而致癌，（2）P53能阻碍DNA聚合酶与DNA复制起始复合物的结合而抑制DNA复制的启动，进而阻止DNA的复制。（3）P53的酸性氨基酸末端结构区具有转录激活作用，它能激活一些抑制细胞分裂的基因而间接抑制细胞增殖。（4）正常P53还能抑制c-myc\\ras基因或腺病毒E1A对细胞的转化作用。 76 癌基因活化致癌的主要机制：
（1）原癌基因点突变（2）原癌基因获得外源启动子而激活（3）原癌基因因甲基化程度降低而激活（4）原癌基因的拷贝数增加（5）基因易位或重排使原癌基因激活
77 肿瘤发生的多基因协同作用：该假说认为细胞癌变是多步骤、多重打击的复杂过程，在肿瘤发生发展的各阶段，至少需要两个或多个不 同的癌相关基因的异常激活或失活，才有可能引起细胞的癌变。
直肠结肠癌的发生、发展过程可分6个阶段：上皮细胞过度增生、早期腺瘤、中期腺瘤、晚期腺瘤、腺癌和转移癌。从正常上皮细胞到上皮细胞过度增生可能涉及FAP基因异常（突变或失活），从早期腺瘤到中期腺瘤涉及K-ras的异常（突变），从中期腺瘤到晚期腺瘤涉及DCC基因异常（如丢失），从晚期腺瘤到直肠结肠癌涉及P53基因异常（丢失），癌转移还涉及到其它基因的激活与失活，如nm23基因表达异常、血管生长因子基因表达在肿瘤细胞表达的Ras刺激下增高等。
78 基因诊断中常用的分子生物学技术（1）核酸分子杂交（2）聚合酶链反就（PCR）（3）单链构象多态性检测（4）限制酶酶谱分析（5）DNA序列测定（6）DNA芯片技术 79 DNA指纹特点：（1）一个DNA指纹探针可同时检测十几个、甚至几十个位点的变异，（2）具有高度特异性（3）具有稳定的遗传性（4）DNA指纹图谱具有体细胞稳定性。 80 基因诊断的方法包括：（1）基因突变检测；（2）多态性分析（3）基因表达的检测（4）外源DNA的检测。
81 基因诊断策略：一、遗传性疾病：（1）直接诊断策略，即直接检测导致遗传病发生的各种基因突变；（2）间接诊断策略，即寻找具有基因缺陷的染色体并判断被检者是否具有这条染色体。
二、感染性疾病：针对病原体的基因序列，设计特异性探针进行分子杂交或合成特异的寡核苷酸引物进行PCR扩增，即能对该疾病作出明确的病原体诊断；三肿瘤：（1）检测肿瘤相关基因的突变及表达异常（2）检测肿瘤相关病毒基因（3）检测肿瘤标记物基因。四、法医：应用DNA多态性分析、DNA指纹技术。 82 基因置换的条件：（1）对导入的基因及其产物有详尽的了解；（2）外来基因能有效地导入靶细胞（3）导入基因能在靶细胞中长期稳定驻留（4）导入基因能有适度水平的表达（5）基因导入的方法及所用载体
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对宿主细胞安全无害。
83 选择转移基因的靶细胞时，一般考虑以下几个因素（1）不管是直接体内还是间接体内基因转移，选择目的基因表达的组织细胞，最好是组织特异性细胞，（2）细胞较易获得，县城生命周期较长。（3）离体细胞较易受外源遗传物质转化。（4）离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内仍较易成活。
目前常用的靶细胞：造血细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞、肌肉细胞、肿瘤细胞。
84 反义RNA在基因治疗中的意义和需解决的问题及前景： 通过反义RNA结合细胞中特异mRNA而调控其翻译，可望按剂量来调节特定基因的表达或功能。问题是：（1）专一性转移问题（2）反义RNA进入靶细胞前的降解问题。（3）受体介导反义RNA转移技术。 前景：（1）安全性高（2）反义RNA设计和制备方便（3）具有剂量调节效应（4）能直接作用于一些RNA病毒。
核对：苏豪杰 焦建宇
技术：胡雷 孙帅领
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