养数代，等这些细菌的DNA只含有氮15N之后，再放入含有14N的培养基中培养，培养1代后，抽取样本提取DNA，再采用氯化铯密度梯度离心法分析。结果发现提取的DNA样本分子密度位于重密度和轻密度之间，如果复制为全保留，那么将只有重密度及轻密度两种DNA的存在。接着，它们提取了第2代DNA，发现一半为中间密度，一半为轻密度，排除了散布式DNA复制的可能。最终实验结果证明了半保守复制模型的正确性。）
2）Leading strands 前导链，即在DNA复制过程中，一条链的合成方向和复制叉前进方向相同，可以连续复制，这条先合成的链即为前导链。
3）Lagging strands 后随链，即在DNA复制过程中，另一条链的合成方向和复制叉前进方向相反，不能连续复制，只能分成若干小片段分别合成，然后连接起来，这条后合成的链即为前导链。
4）Replication fork 复制叉，双螺旋DNA复制时，在DNA链上通过解旋、解链和SSB蛋白的结合等过程形成的Y字型结构称为复制叉。
5）Semidiscontinuous replication 半不连续复制，即DNA复制时，前导链上DNA的合成是连续的，后随链上DNA的合成是不连续的，故称为半不连续复制。
6）Klenow fragment Klenow片段，E. coli DNA聚合酶I经过枯草芽孢杆菌蛋白酶酶切后去除了的5’到3’外切酶活性，保留3’到5’的外切酶活性和5’到3’的聚合功能的大片段即为Klenow片段，而可用于DNA双链末端3’突出端切平和5’突出端补平反应。
7）Nick translation 切口平移，当双链DNA分子的一条链上产生切口时，E. coli DNA聚合酶I就可将核苷酸连接到切口的3’-OH末端。同时该酶具有从5’→3’的核酸外切酶活性，能从切口的5’端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3’端补上核苷酸，从而使切口沿着DNA链移动。
8）Sliding DNA clamps 滑动DNA架子，是一种促持续合成能力的因子，它是DNA聚合酶III全酶的组成成分。在DNA复制过程中，它可以在模板上滑动，并跟DNA聚合酶结合防止其从模板上脱落，因此叫做滑动DNA夹子。
9）Replisome 复制体，即复制叉下所有功能蛋白的联合体。
10）Replicon 复制子，是DNA复制时从一个DNA复制起点开始最终由这个起点起始的复制叉完成的片段，由复制基因和起始因子完成起始。
11）Initiator 起始因子，是一种特异性地识别复制基因中一个DNA序列并激活复制起始的蛋白质。
12）t-loop t-环，由端粒3’单链DNA末端向端粒的双链DNA区域插入产生的环状结构，由于端粒酶不能识别环状端粒，所以t-loop可以控制端粒的长度。
13）Transition/transversion mutatins 转换/颠换，嘌呤与嘌呤或嘧啶与嘧啶之间的突变为转换，嘌呤与嘧啶之间的突变为颠换。
14）AP site AP位点， DNA双螺旋中因丢失碱基而上形成的去嘌呤或去嘧啶的位点统称为AP位点。
15）Photoreactivation 光修复，光裂合酶将DNA中因紫外线照射而形成的嘧啶二聚体分解的过程为光修复，是一种直接修复。
16）Base excision repair （BER）碱基切除修复，DNA糖苷水解酶切除DNA分子中受损碱基而产生AP位点，AP核酸内切酶在5’端切断DNA骨架的磷酸二酯键，并由磷酸二酯酶切除脱氧核苷酸残基，最终由DNA连接酶把两者连成新的被修复的DNA链，这一过程即为碱基切除修复。
17）Nucleotide excision repair（NER）核苷酸切除修复，这种方式可以修复DNA中几乎所有类型的损伤，DNA出现损伤时，多酶复合物识别变形的损伤部位，复合物在其两侧切断DNA，解旋酶将包括损伤在内的DNA片段除去，最后由DNA聚合酶和连接酶完成修复的过程为核苷酸切除修复。
18）Fail-safe glycosylase 自动防故障装置，是一种受损碱基在DNA复制之前没有通过碱基切除的补救机制。由于G的氧化而产生的oxoG:A配对，会有专门的糖基化酶识别并除去未受损的A。同样，在T:G配对中，糖基化酶会认为T是5-甲基胞嘧啶脱氨基产生的而除去T，使其被C取代。
19）Nonhomologous end joining（NEHJ）非同源末端连接，是主要发生在真核生物中的一种修复，其机制是通过断裂末端突出的单链之间错排配对，断裂DNA的两个末端直接相连，由于断裂末端信息丢失，NEHJ的修复具有致变性。
20）SOS response SOS应答，是一种复制后DNA修复系统，它允许DNA的复制可以跨过DNA中的损伤或错误，修复中要使用RecA。
21）Translesion DNA synthesis 跨损伤DNA合成，正在复制的DNA聚合酶遇到没有被修复的损伤，复制机器跨过损伤来完成复制，这种机制就叫跨损伤合成。它由一类特化的DNA聚合酶催化，可以越过损伤部位直接合成DNA。
22）Provirus 前病毒，一种细胞内病毒DNA，它可以整合到宿主细胞基因组，或已整合在宿主细胞基因组中，可随细胞的传代而垂直传播。
2. 简述在DNA复制过程中DNAP的主要底物与合成DNA的机制。
底物：dNTP、引物-模板的接头；
机制：DNA的合成被称为DNA聚合酶的酶所催化，此酶利用单一活性位点来添加4种dNTP前体。
3. 在DNA复制过程中的引物有哪些？
主要有三种：一种是原核生物种由引发酶或DNAP α产生的RNA引物，一种是DNA引物，存在于噬菌体的滚环复制中，还有一种是核苷酸引物，存在于腺病毒中。 4. 如何证明Bidirectional replication？
正在复制的SV40 DNA经过EcoR I酶切后，在电镜下可以发现若干大小不等的复制泡，其中心到两端的距离恒定，提示复制的双向性。 5. 简述E. coli DNA replication initiation的过程。
1）DnaA-ATP与9核苷酸的重复序列结合，产生卷曲DNA复合物； 2）13核苷酸的重复序列变性，形成开放的复合物； 3）在加载蛋白DnaC的帮助下，解旋酶DnaB打开双链。 6. 简述DNA 解旋酶的主要结构特征和功能。
DNA解旋酶为六聚体，含有ATP的结合位点及水解位点，具有极性。它的每个亚基都经历与ATP结合、与ADP结合及没有核酸相连的状态，然后是三个过程的重复，利用ATP水解释放出的能量移动DNA，使其双链打开。 7. 简述Final step in lagging strand synthesis。
DNA聚合酶I切除RNA引物（5’→3’外切），并填补两个冈崎片段的缺口（聚合酶活性），DNA连接酶将3’-OH和5’-磷酸基团连接起来。 8. 简述DNAP III 全酶主要结构特征和各主要组分功能。
DNA聚合酶III主要由四部分组成：1）核心酶，用来合成前导链和后随链；2）τ亚基
二聚体，稳定模板与核心酶的结合； 3）γ复合物，把β亚基装载到后随链的冈崎片段上；4）β亚基二聚体，是DNA的滑动夹子，防止DNA聚合酶从DNA链上脱落。 9. 简述DNAP的三维结构主要结构特征和各主要组分功能。
DNA聚合酶的三维结构像一只半张开的右手，有拇指、手指和手掌组成。
1）手指：①跟引入的dNTP结合，一旦形成正确的碱基配对，手指包住dNTP；②与模板结合，使其磷酸二酯键骨架在活性部位产生约90°的回折，引物后第一个模板碱基暴露，避免了碱基选择的混淆；2）手掌：①校正功能；②监督是否在引物-模板结合处形成正确的碱基对。3）拇指：与催化没有直接关系，它可以在活性位点维持引物-模板的正确位置，并降低解离速率。
10. 为什么DNAP能够选择正确配对的碱基对？
只有在正确配对的情况下，引物3’-OH和在最佳催化位置上的引入核苷三磷酸的α-磷酸才能发生催化反应，不正确的碱基配对使底物处于不利于催化的排列，使得核苷酸的添加效率显著降低。
11. 细胞内rNTP的浓度比dNTP高很多，DNAP却选择后者，为什么？
在DNA聚合酶中，核苷酸结合口袋非常小，不能容纳引入核苷酸上的2’-OH，因此rNTP被排斥在聚合酶活性位点之外。
12. 简述两种金属离子在DNA复制过程中的作用。
一种金属离子主要通过与3’-OH作用，去质子产生亲核攻击的O负离子；另一种与引入的dNTP的三磷酸相互作用，中和它的电荷，起到固定底物的作用。 13. 简述复制工厂假说。
有两种结束时DNA和复制机器相对运动的观点。一种认为复制机器沿着DNA以类似火车沿着轨道的方式运动，触及DNA的两条链得到复制，即两个解旋酶独立工作；另一种观点认为，复制机器是静止的，而DNA在运动，两个DNA解旋酶相互连接，一个DNA聚合酶III全酶只用Waston链为模板，另一个只用Crick链做模板。 14. 简述复制起始甲基化和SeqA蛋白的作用。
只有起始位点完全甲基化才能开始复制，Dam甲基化酶是半甲基化变为完全甲基化。SeqA的作用是阻止全甲基化，并且抑制Dna A与OriC的结合。 15. 简述E. coli、SV40和S. cerevisiea的Replicator主要特征。 其主要特征就是在其复制基因中含共有序列。
16. 真核细胞如何确保每条染色体在每个细胞周期中均复制一次，并且只复制一次？ 通过以下两个机制完成：1）有充足的复制起点，以满足每个S期每条染色体都复制；2）已经复制的复制起点不被再次启动，以保证只复制一次。 17. 比较细菌与真核生物复制引物的主要区别。
细菌的引物由引发酶合成，真核生物的引物由DNAP的α亚基合成。 18. 简述真核细胞复制过程中DNAP 转换。
引发酶合成RNA引物后，产生的RNA引物-模板街头立即与DNA聚合酶的α结合以启动DNA的合成。因为DNA Pol α/引发酶的延伸能力相对较低，所以很快就被高延伸性的DNA聚合酶δ或聚合酶ε取代，DNA聚合酶δ或聚合酶ε取代DNA Pol α/引发酶的过程就是聚合酶的转换。
19. 简述真核细胞复制过程中去除RNA引物的机制。
主要有两种：一种先由RNase HI进行5’→3’外切，剩下最后一个碱基时，由FEN1切
除；另一种由Dna2解旋，然后由FEN1切除引物。 20. 何谓真核细胞过程中“末端复制问题”？应该如何解决？
当后随链复制机器到达染色体末端时，引物酶没有足够的空间去合成新的RNA引物，将导致后随链DNA产物上3’端形成一小段单链DNA，进行下一轮复制时，两个产物中的一个将变短，上一轮没有被复制的区域将丢失，此为末端复制问题。
真核生物通过端粒解决了该问题。首先，端粒酶用其RNA成分与端粒单链DNA的3’端结合，随后利用其反转录活性合成DNA至RNA模板末端，然后端粒酶将RNA从DNA产物上移去并重新结合到端粒的末端，重复上面的过程。只要后随链模板的3’端延伸到足够长，后随链的最后一个冈崎片段就可以完全合成，从而产生完整的子染色单体。 21. 2009年诺贝尔生理或医学奖获得者的主要贡献是什么？ 发现了端粒如何保护染色体，并且发现了端粒酶。 22. 高保真DNA复制主要和哪些因素（步骤）有关？
1）碱基正确的Waston-Crick配对，正好跟DNAP的活性中心相吻合，错误的配对将被排除出活性位点；
2）所有的DNAP都具有相同的三维结构：半张开的右手。它具有校正功能并使正确的碱基对的形成；
3）由于构象不同产生的错配，可以由DNAP在复制过程中得到校正； 4）DNA复制过程中以可以消除的RNA做引物； 5）DNA聚合酶的复制方向为5’→3’；
6）DNA本身包含了可以被校正的遗传信息，比如以T而不用U做碱基。 23. DNA复制为什么必须有引物？为什么没有3’→5’方向的DNA聚合酶？
DNA聚合酶I具有先校正后合成的功能，如果没有引物的存在其校正的功能不能进行，其合成受阻。如果进行3’→5’合成，长链的5’端带有活性的三磷酸基团，这样如果发生复制错误，使核苷酸切除，产生的5’端将丢失两个磷酸基团，正确的核苷酸无法再次加入导致复制终止。
24. 简述Topoisomerases在复制中的作用。
简言之，拓扑异构酶除去DNA解螺旋在复制叉上产生的超螺旋。它通过断裂一条或者两条DNA链但不让其脱落，并且让等数目的DNA链通过缺口来完成。 25. 遗传信息的突变来源主要有哪些？
1）DNA复制产生误差；2）DNA遭受物理或化学损伤；3）转座子的转座作用。 26. 简述E. coli和人DNA复制中如何进行错配修复？
E. coli：首先，MutS扫描DNA链，识别变形的突变位点，然后募集MutL，MutL激活MutH，MutH在错配位点附近产生切口，切的链为非甲基化的链，最后通过DNAP III完成修复。
人的修复过程与其类似，其MSH与MutS同源，MLH与MutL同源，但没有MutH的同源物。由于其没有甲基化标记，可能通过PCNA-MSH的相互作用，将MSH等修复蛋白募集到前导/后随链的合成位点。
27. 有哪些因素可能造成体内DNA损伤？
1）碱基类似物：烷化物，羟化物，去氨基物质；2）可插入碱基的物质（如EB）；3）离子射线，紫外线；4）转座元件，包括逆转录病毒。 28. 体内有哪些NDA损伤修复系统？
直接修复（错配修复、光激活），碱基切除修复，核苷酸切除修复，DSB（真核NHEJ），跨损伤DNA合成。
29. 举例说明DNA损伤导致的突变及其修复机制。
由于紫外线的照射产生嘧啶二聚体，可通过直接修复的方式来完成，即光解酶在可见光的作用下，打开嘧啶二聚体。
30. 真核生物经常发生G:T错配，为什么？如何修复？
由于C脱氨基形成U，这样就形成了G:T错配，可以通过碱基切除修复来完成。DNA糖苷水解酶切除DNA分子中的T而产生AP位点，AP核酸内切酶在5’端切断DNA骨架的磷酸二酯键，并由磷酸二酯酶切除脱氧核苷酸残基，最终由DNA连接酶把两者连成新的被修复的DNA链（同BER）。
31. 简述E. coli NER途径，并与真核生物NER进行比较。
E. coli NER：1）UvrA和UvrB扫描DNA，寻找扭曲；2）UvrA离开复合体，UvrB在扭曲附近将DNA解螺旋；3）UvrC与UvrB形成复合体，UvrC在损伤的5’及3’端产生缺口；4）UvrD将单链片段释放出来，DNA聚合酶I和连接酶对缺口进行修复和填补。
真核生物的NER与原核类似，XPC检测变形，与UvrA类似；XPA & XPD解螺旋，与UvrB类似；ERCCI-XPF切割5’端，XPG切尔3’端，两者与UvrD类似。 32. 何谓“转录偶联的DNA修复”？
NER不仅可以修复损伤，而且在转录过程中也可以帮助RNAP免于模板损伤的困境，在转录偶联的修复中，NER相关蛋白募集到RNAP。 33. DSB损伤是如何形成的？其修复机制有哪些？
1）模板链有缺口，导致复制叉停止前进，最后启动重组的双链断裂；2）模板链有DNA损伤，导致复制叉停止，使复制叉复返，最后启动重组的双链断裂。 34. 简述E. coli修复DSB损伤过程，与人类修复DSB方式比较（略）。
双链破坏→带有3’端单链的间断DNA→3’端得侵入→第二条链的入侵和DNA有3’端开始的修复合成→分支移位和两个Holliday中间体的形成→Holliay连接体的拆分 35. Baltimore和Temin为何荣获1975年Nobel生理学或医学奖？ Temin发现了逆转录现象，Baltimore和Temin分别找到了逆转录酶。 36. 逆转录酶有哪些活性？能自我复制能力的逆转录病毒有哪些基因？
逆转录酶的活性有三：RNA指导的DNA聚合酶；DNA指导的聚合酶；RNase H活性（5’→3’ & 3’→5’）。
基因有三：gap（编码病毒四种核心蛋白，即衣壳）；pol（编码逆转录酶、蛋白酶及整合酶）；env（编码磷脂双分子层的糖蛋白）。
Chapter 10 RNA Biosynthesis
复习题（1） 1. 名词解释
1）Gene expression 基因表达，是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质的过程。
2）C-terminal domain （CTD）C-末端结构域，存在于真核生物RNAP II的最大亚基的C末端，具有7个核苷酸的重复序列，磷酸化的CTD是转录延伸起始所必须，并且可以对mRNA进行修饰。