内皮细胞培养步骤(总结,)
1. .培养人脐静脉内皮细胞： 1 材料与方法 1．1 材料
1．1．1 新生儿脐带 在无菌条件下，于健康产妇分娩后立即取新生胎儿脐带。长度>20 cm，两端扎紧投入到4℃脐带保存液中，1 h内送细胞培养室。
1．1．2 仪器与试剂倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；超净工作台(苏州净化仪器厂)；5％C02培养箱(美国Heraeus公司)；离心机(上海安亭仪 器厂)；25cm2培养瓶、六孔培养板(美国CA)star公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；促内皮细胞生长添加物(ECGS)、M199培养基、I型胶原酶(美国Sigrna公司)；明胶、胰酶(美国A1Tlresco公司)；灭菌生理盐水(锦州医学院附属第一医院制剂室)；鼠抗人Ⅷ因子单克 隆抗体、辣根酶标记的二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)。 1．2 方法
1．2．1 试剂配制 ：(1)脐带保存液：生理盐水、葡萄糖100 mmoL／L、100 U／ml青霉素一100 U／m1链霉素。(2)磷酸盐缓冲液(PBs)。(3)D—Hanks液。(4)0．1％ I型胶原酶：用PBS配制。(5)0．05％胰酶一0．02％ 乙二胺四乙酸二钠盐(ED—TA)溶液：用D—Hanks液配制。
内皮细胞培养液：含20％胎牛血清、
ECGS、肝素，100 U／m1青霉素一100 U／m1链霉素的M199
培养基。(7)0．2％ 明胶：用PBS配制。以上试剂均过滤除菌。 1．2．2 人脐静脉内皮细胞的分离与原代培养： 参照Jaffe 和Lin S等方法并加以改进。在无菌条件下取新生胎儿脐带，长度>20 cm。剪去脐带两端和脐带上有夹痕及血肿部分，尽量挤干净脐带内血液。用生理盐水冲洗脐带表面至无血色。用输血器内接有穿刺器的软管，找到脐静脉，将软管 针头一端插入脐静脉，用止水夹固定，另一端接20 m1注射器，吸取PBS反复冲洗脐静脉直至无血色液体流出为止；将脐带另一端用止血钳夹闭，向脐静脉中灌入0．1％ I型胶原酶溶液，使之充盈，夹闭软管，37℃水浴中孵育20 min，其间轻轻挤压并旋转脐带，以使酶溶液充分接触血管内壁，然后将细胞一酶溶液收集于预先装有温培养液小三角瓶中。用2倍于消化液的温PBS冲洗脐静脉，一并收集于小三角瓶中，将细胞悬液装入10 ml离心管，1000 r／min离心10 min，弃上清，吹打悬浮，再次离心10 min，重悬细胞并接种于铺有明胶的25 cm2培养瓶中，置于37℃ 5％ C02饱和湿度培养箱中培养，24 h后更换培养液，以后每隔2 d换液1次。
1．2．3 人脐静脉内皮细胞的传代培养 当原代细胞融合80％以上后，加入0.05％ 胰蛋白酶一0.02％EDTA 溶液消化，倒置显微镜下观察，当细胞皱缩变圆、彼此分离时弃消化液，加入细胞培养液终止消化，收集细胞悬液。1 000 r/min离心10 min，弃上清，制成单细胞悬液。此时可用0.5％台盼蓝染色，计算活细胞百分率，并以血细胞计数板计数。调整细胞浓度为1×105个／ml，
接种于培养瓶或培养板中继续培养。待细胞长满，彼此融合成片时依上述方法继续传代培养。
补充：1.材料：
a： 脐带>20cm： 建议最好不要取这么长，10～15cm不会影响得到的细胞数，因为你冲洗脐带的时候要把它垂直的提起来，以观察底部流出液体的颜色，要是太长的话，在超净台里很难做到的！ b：脐带保存液：生理盐水、葡萄糖100 mmoL／L、100 U／ml青霉素一100 U／m1链霉素 ： 建议将双抗的量改为十倍，1000u/l，因为原代最大的敌人就是污染，而第一步的取材是最容易污染的，所以要加大量，以后培基里就可以不加双抗了，因为 抗生素对细胞的生长不利。
2.方法（你的不是很详细噢，补充几点）
a：一般15cm左右的脐带用8ml胶原酶就可以了
b：37度消化时间不要20min，那样会消化很多杂质比如成纤维细胞下来的，15cm足以
c：传代的时候用0.25％的胰酶，这样就不用离心了，效果也还不错的说
内皮细胞在异种排斥反应中的作用(REVIEW)
目前异种移植的排斥反应主要包括超急性排斥反应（hyper acute rejection，HAR）、急性血管性排斥反应，acute vascular rejection，）或称延迟性排斥反应（delayed xenograft rejection ，DXR）和细胞介导的排斥反应。其中移植物血管内皮细胞活化所引起的一系列病理改变是引起异种排斥反应的主要环节[1]。由于内皮细胞是移植物与受者免疫系统之间最直接的屏障，内皮细胞不仅是移植排斥反应主要的靶部位，而且本身的一系列反应也介导了移植物的损伤，扮演着双重身份。内皮细胞的活化是由于天然抗体的结合和补体活化所产生的应答和相互作用的结果，是HAR和DXR发生的主要原因[2]。已有大量文献报道通过抑制内皮细胞的活化可以延长异种移植物在受者体内的存活时间。鉴于其在异种排斥中的重要地位，内皮细胞的研究越来越受到移植学者的关注。 一、内皮细胞的活化
血管内皮 细胞位于血管腔内膜表面，为单层紧密排列、互相联结的一层薄膜，构成了一道循环血液与局部组织之间的屏障。这种静息的内皮细胞不具有激活凝集素和抑制白细 胞的附壁功能，因为内皮细胞的表面表达或分泌许多有助于抗凝和行使其它功能的分子，包括：NO、前列腺素、血管紧张素、内皮素、硫酸肝素、血栓调节素和 ATPDase（CD39）等，使内皮细胞具有调节血管紧张性、维持凝血
平衡、调节细胞粘附和抑制炎症反应等功能[2,3]。
当内皮细胞受到损伤或与IL-1、肿瘤坏死因子和内毒素等接触后，即发生一系列代谢和结构的变化，这一过程称为内皮细胞激活。移植物恢复血供后，受者异种天然抗体首先接触的 靶细胞就是供者移植物的血管内皮细胞，之后进一步结合，激活补体，引起移植物内皮细胞活化[2]。Bach将异种排斥反应中内皮细胞的激活分可为2个阶 段：① 早期阶段由补体活化产物诱导，无基因的转录和蛋白合成，称Ⅰ型激活, 包括: 内皮细胞形态变化, 表面硫酸肝素丢失,Ｐ-选择素和vＷＦ（von Willebrand factor）在内皮细胞表面表达，与HAR关系密切；② Ⅱ型内皮细胞激活涉及到基因转录和蛋白合成，导致内皮细胞表面表达粘附分子、细胞因子和前凝血因子等，与DXR相关[1,4]。其中在Ⅱ型内皮细胞激活过程中核转录核因子（Nuclear Factor-κB, NF-κB）起到非常重要的作用，NF-κB是一种基因多显性转录因子，在静息内皮细胞内， NF-κB 和IκB结合形成异二聚体，能抑制NF-κB进入细胞核。内皮细胞的活化涉及一些基因的激活，包括粘附分子（如E-选择素，ICAM-1）、细胞因子（如 IL-1、IL-8等）、生长因子和凝血系统一些成分的基因，这些基因的启动子区域都含有NF-κB的结合部位，内皮细胞活化后，IκB磷酸化降解，导致 NF-κB 进入细胞核，与这些基因启动子上的NF-κB 结合位点结合，上调这些基因的表达[4,5]。
内皮细胞活化后可以多种途径进行应答， 产生一系列活化后反应[2]，包括：①内皮细胞收缩、血管失去完整性、内皮下基质暴露、