组蛋白甲基转移酶Smyd2通过抑制IL-6和TNF-α的产生负调控
巨噬细胞的活性
背景：巨噬细胞在生长和分化中表达Smyd2。 结果：Smyd2抑制巨噬细胞产生IL-6和TNF-α。 结论：Smyd2负调控M1巨噬细胞的极化。
意义：这个发现对于理解巨噬细胞分化的调控具有重要意义，同时也为自身免疫疾病的治疗提供了新的视角。
SET和MYND结构域2（Smyd2），是组蛋白H3K4和H3K36特定甲基化转移酶，在心脏发育和肿瘤发生中发挥重要作用。然而，Smyd2在免疫和炎症中的作用却鲜少报道。在此研究中，我们发现Smyd2负调控巨噬细胞的激活和M1型巨噬细胞的极化。升高Smyd2的表达，包括IL-6和TNF在内的促炎因子的表达则会受到抑制，同时，主要的MHC-Ⅱ和共刺激分子等重要细胞表面分子的表达也会受到抑制。高表达Smyd-2的巨噬细胞上调TGF-Β的表达并下调IL-6的分泌，从而抑制Th-17细胞分化，促进T细胞的分化。在巨噬细胞中，Smyd2特定地促进Tnf和Il6基因启动子上的H3K36甲基化，抑制这两种因子的转录同时抑制NF-κB和ERK信号通路。我们的数据证实，在炎症中，Smyd-2调控Tnf和Il6启动子上H3K36二甲基化的表观遗传调控在调节巨噬细胞的活性中发挥重要的作用。
固有免疫是人体抵抗细菌、病毒、寄生虫和真菌的第一道防线。当机体抵御外界病原菌时，固有免疫首先被模式识别受体激活。模式
识别受体由免疫细胞表达，识别与感染病原体有关的病原相关分子模式。Toll样受体（TLRs）是一类典型的模式识别受体，它们能促进巨噬细胞和其他吞噬细胞识别入侵的病原体，并且诱导免疫应答，产生促炎因子和趋化因子。TLRs诱导多种信号通路，如NF-κB、MAPK通路，并能激活NF-κB、ERK、p38、c-Jun等一系列转录因子和激酶。这些转录因子协同促进多种下游基因如TNF和IL-6的表达，最终激活巨噬细胞。
以解剖位置和功能表型为依据，巨噬细胞可分为多种亚型。定位于特定组织中的巨噬细胞有破骨细胞，肺泡巨噬细胞，组织细胞和库佛细胞。若以巨噬细胞的功能表型为依据，巨噬细胞可以分为经典方式活化的巨噬细胞（M1）和选择性通路活化的巨噬细胞。M1型巨噬细胞产生大量的炎性细胞因子，其中包括TNF-α和IL-6等，并在清除各种病原菌和抗肿瘤免疫中发挥重要作用。M2型巨噬细胞，具有抗炎特性，在伤口愈合、组织修复、血管生成、肿瘤发展和寄生虫感染的免疫应答中发挥重要作用。当有病原菌或相关的细胞因子的刺激时，巨噬细胞的活性和基因表达谱均有显著改变，且这些变化由基因、表观遗传和转录严格调控。巨噬细胞识别和功能的紊乱可能导致克罗恩病、类风湿性关节炎、多发性硬化症和自身免疫性肝炎等慢性炎症或自身免疫性疾病。
越来越多的研究表明，表观遗传调控在巨噬细胞激活和功能性分化中起重要作用。真核染色体的基本单位核小体，由四个核心蛋白（H2A，H2S，H3，H4）包裹146bp的DNA片段组成。基因表达可由
组蛋白翻译后修饰严格调控。这些修饰包括甲基化、乙酰化和磷酸化。异常的组蛋白修饰与多种人类疾病密切相关，同时也是一些炎症性或自身免疫性疾病的生物学诊断标志和治疗靶点。组蛋白赖氨酸甲基化是一个典型的翻译后修饰，包括H3K4、H3K27、H3K36甲基化。H3K4的三/二甲基化和H3K36的二甲基化与转录基因的激活有关，无论是H3K36的二甲基化还是H3K27的三甲基化都与相应基因的沉默有关。有报道称组蛋白赖氨酸甲基化在巨噬细胞的极化和激活中发挥重要的作用。也有文献报道H3K27的去甲基转移酶Jmjd3在M2型巨噬细胞的激活中发挥重要作用。而另一篇文献却报道在LPS诱导激活的巨噬细胞中，有一个保守的SET结构域的H3K4组蛋白甲基转移酶Ash1l调控IL-6和TNF-α的生成。
SMYD家族包含五个甲基转移酶，命名为Smyd1-5。该家族包含一个SET结构域，且被MYND结构域分为两个片段。文献报道，在肿瘤细胞增殖和心肌细胞成熟中Smyd1-4发挥重要的作用。在HSP90α缺失的情况下，赖氨酸甲基转移酶Smyd2，二甲基化H3K36，从而抑制基因的转录。然而，在HSP90α存在的情况下，Smyd2转甲基给H3K4，使基因转录。另外，Smyd2不仅仅使组蛋白甲基化而且也能使非组蛋白甲基化。例如，肿瘤抑制因子p53赖氨酸370位点的甲基化使它的功能受损，且视网膜母细胞瘤蛋白赖氨酸860位点甲基化会使它的靶基因受抑制。一个最近的研究阐释免疫系统的细胞表达Smyd2。然而，Smyd2在调控免疫应答和炎症反应中的作用仍未知。
我们最初观察得到当LPS刺激巨噬细胞激活时，Smyd2的表达显
著地下调，也就是说Smyd2负调控巨噬细胞的活性。我们的研究也证实了我们最初的。这证明Smyd2在巨噬细胞激活中是一个负调控因子。我们发现在原始巨噬细胞中，过表达的Smyd2可抑制TNF-α和IL-6的表达。且数据表明Smyd2通过抑制H3K4的三/二甲基化，促进H3K36的二甲基化作用来调控TNF-α和IL-6的生成。另外，过表达的Smyd2降低NF-ΚB的活性，诱导RelA结合在靶基因的启动子片段上。重要的是，改变巨噬细胞中Smyd2的表达，可有效调节T细胞（Treg）和Th-17细胞的分化。因此，我们的研究对于理解巨噬细胞分化的调控具有重要意义，且为自身免疫性疾病的治疗提供新的角度。 实验步骤
动物——中国科学院上海实验动物中心购买C57BL/6小鼠。小鼠被保存在无病原体的微振笼中，并且所有的实验小鼠均在6-8周龄。所有的动物实验均被苏州大学实验室动物护理和使用机构批准。 巨噬细胞分离培养-收集小鼠股骨和胫骨骨髓细胞，在巨噬细胞分化培养基中培养——培养基的成分为：RPM11640（Invitrogen），10％FBS，100单位/ml青霉素，100单位/ml链霉素，并添加100ng/ml集落细胞共刺激因子，细胞以2×106 /ml（6孔板）的密度培养6天，且培养基在第三天更换。培养6天后，收集贴壁细胞并转染，24h后收集细胞并用100ng/ml LPS刺激巨噬细胞激活。
T细胞提纯——用CD4分离试剂盒纯化CD4+T细胞。用FACS进一步提取CD+CD25-T细胞，细胞的纯度大约为95％。
T细胞和巨噬细胞的分化与培养——在iTreg细胞分化（rhTGF-β1,3ng/ml）或Th-17细胞分化
（IL-6,10ng/ml;rhTGF-β1,3ng/ml;anti-IL-4,10μg/ml;anti-IFNγ,10μg/ml）的条件下,用CD3(3μg/ml)和CD28(2μg/ml)的抗体刺激纯化的CD4+CD25-细胞。并分别用Smyd2质粒或者对照组突变型质粒以1∶1的比例转染巨噬细胞并培养3到4天。
质粒转染——Smyd2质粒（批号 no.MC204022）和对照组质粒(批号 no.PS100001)购至OriGene。构建Smyd2点突变的突变型，引物为： 5＇CGAGGTGTTCACCAGCTTCATCGACCTGCTATATCC; 3＇GGATATAGCAGGTCGATGAAGCTGGTGAACACCTCG。
如前所述构建Il6和Tnf荧光报告基因质粒。Pgl3荧光对照质粒和内参TK质粒购自Promega。用
Il6（5＇-CCTCTAGATAGTGCGTTATGCCTAAGCA-3＇;
5＇-CCTCTAGAGTTTGAAGACAGTCTAAACAT-3＇）和Tnf的引物构建报告基因。所有构建的报告基因均用DNA测序验证。用小鼠巨噬细胞核转染试剂盒进行巨噬细胞转染。
RNA干扰——特定的小鼠Smyd2小干扰RNA1，在目的基因中加入SMART缺陷的鼠Smyd2（catalog no.226830）。乱序的RNA对照购自Dharmacon。另一个特定的Smyd2小干扰RNA2购自Santa Cruz Biotechnology。用小鼠巨噬细胞核转染试剂盒转染siRNA双螺旋。 实时定量PCR——用RNA提取试剂盒 (Qiagen)从细胞中提取总RNA，然后用逆转录试剂盒(Bio-Rad)合成cDNA，然后用ABI 7900HT