(Applied Biosystems)实时定量PCR来检测基因的表达。其中，PCR所用的特定引物为：
鼠 Smyd1, 5′-TCAGTGACCAGAGAGGGCTAC-3′
5′-AGCTCAATCTTGCCATTGTTGAA-3′;
Smyd2，5′-ACTGCGACGTGGAATGTCAG-3′
5′-CGCACAGTCTCCGAAGGAT-3′; Smyd3，5′-CCGACCCCTTGGCTTACAC-3′
5′-CGGCATTGAGAACAACGCATC-3′;
Smyd4, 5′-GGTGGATGAATGGAAGTCCTACC-3′
5′-CCTCAGGTTGAAGAAGGGAAGAA-3′; Smyd5，5′-GGCACCCCCTCAATAAGCTG-3′
5′-ACCCAGTGGTCCTTGTCCTT-3′; IL-6，5′-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3′
5′-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3′; TNF-α，5′-CCCTCACACTCAGATCATCTTCT-3′
5′-GCTACGACGTGGGCTACAG-3′; β-actin，5′-TGTCCACCTTCCAGCAGATGT-3′
5′-AGCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3′。
Western Blot——用包含PMSF和蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀缓冲液裂解细胞。SDS-PAGE分离裂解混合液，并通过蛋白免疫印迹分析。所用抗体Smyd2，phospho-IKKα/β，IKKα/β，phospho-IκBα, IκBα，phosphop65，p65，phospho-ERK1/2，ERK1/2， phospho-p38，p38，
phospho-c-Jun和 c-Jun均购自信号转导公司。抗-β-actin抗体购自SigmaAldrich。富士las4000发光成像仪曝光作用化学发光底物的印迹，并用ImageJ软件绘图（国立卫生研究院）。
ELISA——从R＆D公司购买ELISA试剂盒检测培养基上清中，细胞产生的TNF-α，IL-6和IL-17等细胞因子的水平。
荧光素酶报告基因表达的分析——指示剂pGL3-luciferase报告质粒与Prl-tk-Renilla-luciferase质粒（内参）共转染RAW264.7巨噬细胞，并检测Smyd2和内参的表达。转染24h后，LPS刺激细胞。双荧光素酶报告系统检测荧光素酶的活性（Promega）。荧光素酶检测实验确定荧光素酶活性，从而确定转染效率，统一数据。与对照组，实验组的比值成倍增加。
CHIP实验——购买CHIP试剂盒（Millipore），按说明书进行CHIP实验。实时定量PCR分析免疫沉淀DNA和内参DNA，用内参DNA来标准化结果。ChIP 所用抗体, Smyd2 (catalog no.ab108217), H3K4me2 (catalog no. ab7766), H3K4me3 (catalog no.ab12209),H3K27me3 (catalog no. ab6002),和H3K36me2(catalog no. ab9048)均购自Abcam。ChIP试剂盒EZ-ChIPTM (catalog no. 17-371)购自Millipore.以下启动子引物被CHIP实验放大：
Il6，5′-GAATGGGATCA-3′（正义链）
5′-GGTGGGTAAAGTGGGTGAAG-3′（反义链）； Tnf，5′-CAGCCACTTGGCTA-3′（正义链）
5′-CGGATCCCATGGACCAACTG-3′（反义链）；
Tafaip3，5′-TTGAATGGTGGTGGTCTTCA-3′（正义链）
5′-TGAGGAGGAGGGGAATAACC-3′（反义链）；
Il12b，5′-CCCTGGATACAGACAACA-3′（正义链）
5′-GTGAATAGAGGCGGCAAT-3′ （反义链）； Jmjd3，5′-TAAGGATTAGGAGGGAAGAG-3′ （正义链）
5′-CTGGTGTAGGCAGGTTCT-3′ （反义链）
流式细胞—细胞与鼠CD4，CD11b，CD80，CD86，MHC-Ⅱ，CD40，IL-17，Foxp3，IFN-γ抗体结合使细胞表面和细胞内染色。FACS抗体购自eBioscience。在高尔基阻滞的情况下，分别用佛波醇12肉豆蔻酸13酯（100ng/ml）和离子霉素（100ng/ml）（BD Biosciences，1:100）刺激细胞5h，胞内IL-17和IFN-γ染色。
统计分析—用位数的t检验分析数据，且认为p<0.05有统计学意义。（*, p< 0.05; **, p < 0.01）。 结果
随着巨噬细胞的激活，Smyd2的表达减少。在本次研究中，用巨噬细胞集落刺激因子（MCSF）刺激鼠巨噬细胞，使之分化为成熟的巨噬细胞（i.e. M0 巨噬细胞）。随后LPS刺激，M0巨噬细胞极化为有活性的巨噬细胞。我们首先用LPS诱导巨噬细胞激活，测量Smyd家族成员mRNA的表达。发现在这个过程中，仅Smyd2和Smyd3的mRNA的表达有显著的降低（Fig.1A）。因此，我们选择Smyd2做进一步研究，探索它在LPS诱导激活巨噬细胞中的作用。我们分析在分化的巨噬细胞中Smyd2的表达，发现Smyd2在骨髓细胞和分化的M0细胞中的转录
水平并没有显著的差异（Fig.1B）。之后，我们检测Smyd2在LPS诱导M1细胞分化过程中的表达结果，详细分析Smyd2在多个时间点的转录和蛋白水平，发现Smyd2的表达依赖LPS的刺激。在巨噬细胞激活过程中，Smyd2的表达水平随着刺激时间变长，逐渐降低（Fig.1，C和D）。有报道Smyd2有甲基转移酶活性，因此我们构建了表达Smyd2全长的质粒和Y240F点突变催化质粒，来检测Smyd2的甲基转移酶活性是否与LPS诱导巨噬细胞的激活有关。用荧光素酶报告基因实验检测，对比空载体和Smyd2突变型对照组，Smyd2的过表达显著地以剂量依赖的形式抑制LPS诱导产生的TNF-α和IL-6的荧光素报告基因（Fig.1E）。这些数据表明，以Smyd2的甲基化活性为基础，Smyd2在LPS诱导的M1型巨噬细胞极化过程中起负调控作用。
在激活的巨噬细胞中，Smyd2的过度表达抑制IL-6和TNF-α，这一作用与Smyd2的甲基化酶活性有关。为了清楚Smyd2在巨噬细胞极化中的作用，我们过表达M0巨噬细胞中的Smyd2和对照组的突变质粒，然后用LPS刺激使这些巨噬细胞极化。LPS的刺激后，用实时定量PCR和ELISA检测TNF-α、IL-6等主要的促炎因子的产量。如图Fig.2，A和B，与突变型对照组比较，无论是从mRNA水平还是蛋白水平来看，巨噬细胞中Smyd2的过表达均显著地抑制TNF-α和IL-6的表达。同样地，通过特定Smyd2干扰RNA降低Smyd2的表达，TNF-α和IL-6的表达在mRNA水平和蛋白水平均显著且稳定地升高（Fig.2，C和D）。这些结果表明，Smyd2依赖其甲基化转移酶活性，通过抑制TNF-α和IL-6的表达来抑制LPS诱导的M1巨噬细胞的活性。
进一步研究，我们检测了Smyd2过表达巨噬细胞中与巨噬细胞功能相关的重要表面分子标志物的表达。结果显示Smyd2的过表达显著地抑制MHC-Ⅱ和共刺激分子CD80和CD40 的表达（Fig.2E）。然而，与对照组对比，CD86的改变并不明显。这些数据说明，Smyd2可能通过其甲基化转移酶活性负调控巨噬细胞的抗原提呈功能和巨噬细胞诱导的炎症免疫应答。
巨噬细胞中，Smyd2负调控NF-Κb和MAPK信号通路——在应答LPS的刺激时，NF-Κb和MAPK调控TLR4信号转导通路下游这一过程对TNF-α和IL-6的产生起重要作用。为了探究Smyd2调控TLR诱导TNF-α和IL-6的产生机制，我们使TLR诱导的巨噬细胞过表达Smyd2，检测NF-κb和MAPK通路上的重要信号分子的活性。过表达Smyd2使IKKα，IKKβ和IκBα的磷酸化显著减少。另外，IκBα的降解也会相应延迟减缓，与对照组相比，P65的磷酸化也明显地下降（Fig.3A）。这些数据表明，在M1巨噬细胞中，过表达的Smyd2以时间依赖的方式抑制NF-Κb通路的活性。同时，我们也进一步检测了LPS刺激M1巨噬细胞极化过程中，ERK，p38，c-Jun MAPK激酶的活性。如图Fig.3B所示，Smyd2的过表达导致ERK磷酸化的显著降低。然而，对比实验组和对照组，c-Jun和p38的磷酸化水平差异却不明显。这说明，Smyd2仅调控ERK介导的信号通路，而并不对JNK-和p38-介导的信号通路起作用。总的来说，我们的研究表明Smyd2以它的甲基化转移酶活性为基础，通过抑制NF-Κb和ERK的信号转导，负调控TLR介导的巨噬细胞活化，最终使TNF-α和IL-6的产生减少。