【根据文献(Shujun Chang, 1993) CTAB法，稍作改进。】 1、 将4mL提取液加入到lOmL离心管c卜650C水域加热。
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2、 用液氮冷却研钵，在研钵中加入少量的抗氧化剂PVP，取1g低温冷冻的银杏叶片，迅速置于研钵中，不时加入液氮以防止研磨过程中叶片融化，充分研磨后，立即加入到预热好的提取缓冲液中，用手摇功混匀。 3、 65℃，水域1 min后冷却至室温。
4、 加入等体积(4mL)的氯仿:异戊X17 (2=L: 1)，混匀，10000rpm, 40C，离心10 min。
5、 小心吸取上清液，加入等体积(4mL)的仿:异戊醇(24: 1),混匀，10000rpm, 40C,离心10 min。 6、 吸取上清液，加1/4体积的IOMLiCL,混合，4℃沉淀过夜，然后10000rpm离心20 min。
7、 用枪吸干，用500u L SSTE溶解沉淀，转到1.5m L离心管.加等体积氯仿:异戊醇混匀，10000rpm, 40C，离心10 min。
8、 离心吸取取上清液，加两倍体积的无水乙醉，-70℃沉淀至少30 min，或一200C下沉淀2 h。
& @9 l7 X1 x8 t6 u9、 12000rpm, 40C,离心20 min，去上请用70%的乙醇洗两次，吹干沉淀。
' ^' p: r4 \\9 T: S. D10、 用40 u LDEPC处理的水溶解沉淀，得到RNA样品。 11、 除用于电泳和紫外检测外，其余RNA-70℃冰箱保存备用。
% Z p\改良Krapp提取法： 试验试剂：
1、 RNA抽提掖：母液：4mol 异硫氰酸胍 20mmol EDTA 20mmol MES pH 7.0。工作液：取400ml母液加入1.7ml 2-ME贮存在4℃条件下备用。
2、 RNA重悬液：2mol LiCl 10mmol NaAc调整终体积为250ml，pH 5.2，灭菌后贮存在4℃条件下备用。
~; I/ u试验步骤：
& ~4 j: J9 h0 h% S1、 取新鲜植物材料0.5~1g，冷冻干燥。如果必要可加入0.2g砂一起研磨，然后加入 10ml RNA抽提掖充分混匀。
2、 4℃条件下8000rpm离心10min，将上层水相转移至一干净离心管中，加入等体积的酚/氯仿抽提掖，在4℃条件下8000rpm离心10min。
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3、 上清液转移至一干净离心管中，再用10ml氯仿洗上清液1次（加入10ml氯仿充分混匀后，在4℃条件下8000rpm离心10min.）。
4、 小心将上清液转移至另一干净离心管中，加入1/10 vol 3mol NaAc和2 vol冷无水乙醇，在-80℃条件下沉淀2小时。
5、 在4℃条件下8500rpm离心30min.，小心弃去上清液，沉淀重悬于RNA重悬液中，置于4℃条件下1小时。
6、 4℃条件下8500rpm离心10min.，弃去上清液，沉淀溶于适当体积的DEOC处理水中。检测后分装，置于-70℃条件下保存。 一些特殊组织的RNA提取
1、 纤维组织：
& n. x! M; e( O' 心脏/骨骼肌等纤维组织提取RNA的关键在于彻底破碎组织。这些组织细胞密度低，单位重量的组织RNA的含量就少，建议用尽可能多的起始量。使用TRNzol法可以提取纤维组织终RNA，由于纤维组织终RNA含量较少，可按照增加的起始量成比例增加TRNzol的用量，并在液氮中将组织彻底磨碎，同时适当减少溶解RNA的溶液体积。
2、 蛋白/脂肪含量高的组织：
动物的脑和某些特殊的植物组织中，脂肪或者蛋白的含量很高，可以采用TRNzol来提取此类样品中的RNA。在该提取过程中，用氯仿抽提后，如上清仍含白色絮状物，必须用氯仿再次对上清进行抽提。使用TRNzol提取脂肪含量高的组织中RNA时，使用氯仿抽提后会分成油滴、水相（含RNA）、DNA中间层、有机相四层，应用移液管小心吸取水相液体，避免吸到油滴层和DNA层。 3、 核酸/RNase含量高的组织：
脾、胸腺、胰脏等组织的核酸和核酸酶含量很高，可以在液氮中碾磨组织，再快速匀浆。如果裂解液太粘稠（因为核酸含量高的缘故），酚/氯仿抽提不能有效分层，可以加入更多裂解液以解决此类问题。如果加入乙醇后马上有白色沉淀形成则表明有DNA污染，可以在核酸溶解后用酸性酚/氯仿再次抽提，去除DNA污染。
4、 植物组织和真菌组织：
植物组织和真菌组织比动物组织更为复杂，因此为了避免出现内源酶作用使 RNA降解的现象，一般选择在液氮条件下对植物或者真菌材料进行碾磨。如果降解问题不能解决，基本上是由于样品中的内含杂质导致。许多植物和真菌中的内含杂质如多糖、多酚等都会残留，因为这些杂质分子与RNA有一些相似性，可以与RNA同时沉淀或者吸附，因此在植物和真菌组织的RNA提取过程中，需要用一些特别的步骤或者特别的试剂（RNAplant）来去除多糖多酚等杂质的干扰和污染。
RNA纯化
试验步骤：
用酚氯仿抽提：这两种有机溶剂合用，比单独用酚抽提的除蛋白效果更佳。继而用氯仿抽提则可除去核酸制品中的痕量酚，先加入酚后加入氯仿。
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1、 核酸样品置有盖小离心管中，加入等体积的酚/氯仿（如有20ul样品，则加入10ul酚10ul氯仿）。 2、 旋涡混匀管内容物，使呈乳状。3、 12000×g室温离心15秒。
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! C* z+ ]- L; q: u; T\B0 G4、 水相移入另一离心管，弃去两相界面和有机相。
5、 重复步骤1－4步操作，直至两相界面上见不到蛋白质为止 6、 按下述核酸浓缩法沉淀回收核酸。
7、 2－8度，离心，10500rpm/min，15min,取上清，用200ul在20ul刻度使用，小心不要使界面混淆，剩余界面上不要）。
8、 上清中加入等量的异丙醇(一般是0.5:1),颠倒5次（用200ul枪加小心），室温静置10min。 9、 2-8度离心，10500rmp/min,10min,弃上清。
10、 RNA洗涤：75％酒精（这次用的100％。未影响）1ml沉淀，轻轻弹其底部（直接放入－70度冰箱可以长期保存，静置几秒钟。
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) c9 k& i+ p\11、 2－8度离心，8500rpm/min,5min ,弃上清。
12、 取出滤纸，将EP管敞开放在滤纸上，管口向酒精灯（不要完全干燥，不好溶解）。
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13、 ?DEPC水溶解（30ul,可变），分装,2ul电泳，2ul比色，其余5ul分装至于手套中冻于－20度中。
植物组织mRNA提取
由于mRNA末端含有多poly(A)+，当总RNA流径oligo(dT)纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的mRNA。 实验步骤：
1、 用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。
2、 将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。 3、 用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。
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4、 将提取的RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x柱层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。
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5、 测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时，加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。
* A' g7 a0 l( Z( k# Y6、 测定OD260，合并含有RNA的洗脱组分。
7、 加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)， 2.5倍体积的冰冷乙醇， 混匀， -20℃30分钟。
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8、 4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗 涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。 9、 小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。
10、 用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）。
( B$ `+ H1 e, d$ x. Z注意事项：
1、 mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。
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2、 oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3)冰箱保存，重复使用。每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。
mRNA纯化
mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异
地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。 寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA：试剂试剂：
1、 3M醋酸钠（pH 5.2）
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2、 0.1M NaOH
# J0 a7 \\- E) T3、 1×上样缓冲液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）的10%SLS至终浓度为0.1%。 4、 洗脱缓冲液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS5、 无水乙醇、70%乙醇
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6、 DEPC
1 z! S3 x, d8 z8 F试验步骤：
1、 将0.5-1.0g寡聚（dT）-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。
2、 用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管，将寡聚（dT）-纤维素装柱0.5-1ml，用3倍柱床体积的DEPC H2O洗柱。
3、 使用1×上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。
4、 将RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2×上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后，再用1×上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。5、 将所有流出液于65℃加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。
6、 用5-10倍柱床体积的1×上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集，OD260测定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其内含物为无Poly(A)尾的RNA。后部分收集管中流出液的OD260值很低或无吸收。 7、 用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly(A+)RNA，分部收集，每部分为1/3-1/2柱体积。
8、 OD260测定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10体积3M NaAc（pH5.2）、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。
9、 4℃离心，10000g×15min，小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。[注意：此时Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。4℃离心，10000g×5min，弃上清，室温晾干。10、 用适量的DEPC H2O溶解RNA。 注意事项：
1、 整个实验过程必须防止Rnase的污染。
2、 步骤4中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构，使Poly(A+)尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。
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3、 十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动，若室温低于18℃最好用LiCl替代
NaCl。
4、 寡聚（dT）-纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。每次使用前应该依次用NaOH、灭菌 ddH2O、上样缓冲液洗柱。
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5、 一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，约相当于上柱总RNA量的1%-2%。
RNA提取注意事项
一些RNA提取方法，在进行具体实验时，应根据研究对象的性质，提取核酸的用途而对上述方法在操作步骤和试剂使用量上作一定的修改。
+ P- Y6 d* b$ y r 1、 在核酸提取时，为了增加细胞的裂解度，增加核蛋白复合体破碎度，以释放更多的游离核酸，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K，在确保没有核酸水解酶存在的前提下，酶反应时间越长越好。
2 \\\w4 \\2、 有时在使用蛋白酶时，为了抑制核酸水解酶的降解作用，可在蛋白酶缓冲液中用终浓度5mM的EDTA代替NaCL，并且可将反应温度提高到50－60℃，并将反应时间缩短到15－25min，但酶用量必须提高10－20倍。溶菌酶使用时缓冲液中需加EDTA，因游离金属离子对酶有抑制。
3、 许多植物材料中富含酚，在细胞破碎时，在多酚氧化酶作用下，被氧化成有色的锟类物资，影响核酸的提取及降低提取质量，在提取液中加入PVP和巯基乙醇对降低酚类的干挠可能有所帮助。PVP将与酚形成复杂的聚合体，在提取时将酚从核酸成分中游离。且PVP与巯基乙醇作为强还原剂可防止多酚的褐变。另外作为还原剂的这些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。
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4、 许多生物材料在提取核酸时，都会遇到多糖的污染问题，具体表现为有机溶剂沉淀时，沉淀很多，但复溶时，大量沉淀不溶，电泳观察时核酸含量很低。
6 |! @ R6 P 克服多糖污染可采用以下一些办法
- s1 t4 C- L* W$ ~* 1) CTAB多次抽提。
+ v5 s8 t1 ]\ X2) 在有机溶剂沉淀时先稀释样品浓度（可到10倍左右），对低浓度样品再进行沉淀。
3) 在有机溶剂沉淀时选用异丙醇和5MNaCL作为沉淀溶剂，此时氯化钠的用量可用到1/5-1/2的体积，异丙醇可用到0.6-1的体积。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。
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5、 在核酸提取时，酚与氯仿均起到变性的作用。酚的变性能力强于氯仿，但酚与水有一定的互溶，因此酚抽后，除可能损失部分核酸外，水相中还会残留酚，而酚的存在将对核酸的酶反应产生强的抑制，因此在操作中可单用氯仿作变性剂、也可用酚/氯仿混合变性，也可用单一酚作变性己，但用单一酚后在有机溶剂沉淀时一定要用氯仿从抽提。
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6、 在操作中当加入变性剂氯仿后，为了保证核酸样品的完整性，操作要轻，尤其在提DNA时，更要避免剧烈操作。
7、 在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。