8、 在提取核酸时，如样品浓度低，则应增加有机溶剂沉淀时间，－70℃下>30min;－20℃过夜将有助于增加核酸的沉淀量。
( M% P% Q\9、 在核酸提取过程中有机溶剂沉淀后复溶时可加水因此时离子浓度可能较高，而到高度纯化后低温保存时最好复溶于TE缓冲液中，因溶于TE的核酸储藏稳定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸样品保存时要求以高浓度保存，低浓度的核酸样品要比高浓度的更易降解。
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10、 核酸提取后可通过PCR 、RT－PCR直接扩增出目的基因片断，也可首先构建文库、然后由RACE、dd-PCR等差异显示技术、AFLP等标记技术、差异杂交或文库扣除技术等方法筛选出特异探针，再用此探针从文库中筛选出完整基因。
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11、 在抽提过程中，若蛋白质含量或其它的杂质还较多，可以增加抽提次数.提取RNA请尽量在低温下操作，如果条件不容许，在室温下操作的时间要尽可能的短。 防止RNA酶污染的措施：
1、 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2、 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3、 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
4、 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。 5、 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。 6、 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
7、 DEPC能与胺和巯基反应,因而 含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理
8、 加样原则是DNA最后加，其他试剂按照体积大小从大往小的加。如果是同种引物和探针有多管的话只是DNA不同，那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面，混合均匀之后再分装到各个管子里去，这样可以有效地避免误差及污染。
9、 普通实验室容易污染，且污染程度很高，与跑电泳还有质粒制备提取都在同一个房间里有比较大的关系，最容易造成高浓度污染的就是产物的开盖和质粒的稀释。因此要格外注意一些。 常用的RNA酶抑制剂： 1、焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
2、 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。
3、氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。
4、RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。
5、其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。因为DEPc不加选择的修饰蛋白质和RNA，因此在分离和纯化RNA过程中不能使用，而且它与一些缓冲液(例如Tri)不能相容在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。 附确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法：
按照样品浓度，从RNA溶液中吸取两份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的离心管中,并且用pH7.0的Tris缓冲液补充到10 ul的总体积，然后密闭管盖。把其中一份放入70℃的恒温水浴中,保温1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。取出两份样本进行电泳。电泳完成后，比较两者的电泳条带。如果两者的条带一致或者无明显差别， 则说明RNA溶液中没有残留的RNA酶污染，RNA的质量很好。相反的，如果70℃保温的样本有明显的降解，则说明RNA溶液中有RNA酶污染。
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用Trizol 抽提的RNA，用琼脂糖凝胶电泳，出现许多条带(至少四条以上)，是哪些原因导致的？参考见解：
1、 是从组织里抽的还是细胞抽的？组织的RNA电泳不理想，但目的条带仍能跑出来。细胞的电泳相当漂亮，但有时逆转录效果反而不好。组织经常出现这种情况，组织抽提的RNA不纯，而且多多少少有降解。不过下一步可以接着做逆转录，可能对后面的实验影响不会很大。
2、 是mRNA的话，这样的效果挺不错的。如果是总RNA，那是降解了。不过细胞的RNA应该不容易降解，可以上样少点再跑胶。
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3、 可以试试在70度加热5分钟,然后再跑跑电泳可能有意想不到的结果.
4、 建再进行RNA精致的过程,也就是Trizol后,加氯仿,吸取上清尽量少吸,然后将其再按规程离心一次吸取上清后加入异丙醇,然后再用70%冰乙醇洗两次可见RNA,如果还是不行的话最好用柱式吸附柱将上清与70%冰乙醇混合后过柱怀疑这种属于基因组DNA污染在操作过和的preeogress降解.所以一定要按规程进行抽提.
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所有的准备工作如干烤、DEPC浸泡等均按分子克隆上说的处理了，可是就是提取不出RNA来。异丙醇沉淀后在管底也有乳白色的东西，用DEPC水溶解却溶解不了，很粘稠。电泳什么也看不见。用的组织是小鼠的肺和脾脏，TRIZOL用的是GIBCOL的。组织和TRIZOL的比例为每50mg用1ml TRIZOL。为什么？
1 [3 o& _' D: q# i参考见解：乳白色的东西有可能就是RNA,一定要溶解,实在不行就在70%乙醇洗过后迅速空气干燥一下,加DEPC水,还溶解不了就65度加热10分钟.好象100mg组织加1mlTRIZOL足够了。
/ e\在没有液氮的条件下，直接研磨组织成粉末再加入TRizol中，对RNA提取的质量会不会影响很大？或者在研磨过程中直接加入TRizol研磨直到成粉末，这样可不可取？
参考见解：在没有液氮的条件下，直接研磨组织成粉末再加入TRizol中，这样RNA早就没有了。 要是在研磨过程中直接加入TRizol研磨直到成粉末，可以观察组织,看研磨得什么样子了,磨的差不多时加trizol,可试一下,镜下观察然后确定加入trizol试剂。
用Tiangen的TRNzol提的月见草（柳叶菜科）叶片RNA，跑电泳结果发现RNA已经降解了。后换了烟草的叶片，同样的提取，出现18s,和28s的两条带，结果比月见草好。但是没有到18s:28s=2:1的程度。而且下面还有多出来的条带，不知道是5s，还是降解了的RNA。下面是电泳图，第二道是烟草总RNA，OD260/280=1.82，第三道是月见草总RNA，OD260/280=3.05。普通琼脂糖胶0.8%，130v,20min请问： 1.烟草的RNA的结果足够做RT-PCR了吗？想分析的是叶绿体上的几个基因。
2.想换用TRNzol以外的RNA提取试剂和方法试试。或者换用其它品牌的TRNzol。不同的物种差异还是很大，提月见草时沉淀出的RNA有浅浅的紫色，不知道是否有什么物质影响了RNA的提取。 参考见解：
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; R9 D' h+ ]/ M7 h6 l: 从电泳图分析：
1、 月见草的RNA已经降解了。
2、 烟草的RNA可以做RT-PCR，质量和纯度都不错。“下面还有多出来的条带”应是叶绿体RNA,是在植物
RNA提取中常见的情况.
3、 不用换Trizol，把条件控制严一点，应该能提得好的，多摸摸条件。
4、 用过Qiangen的RNA Easy效果极好.天为时代的RNA Plant也不错,只是试剂味道大了点. 听说天为时代现在好像也有与Qiagen RNA Easy类似的盒子.不过RNA Easy系列的试剂盒提取某些植物会有微量基因组DNA污染, 需RNase free的DNase处理.用过inventroge TRizol,效果不错.
! {# `) W8 q! ^, H! }黄曲霉rna提取（trizol法），加完异丙醇沉淀后得到的是接近透明的沉淀，加75％酒精洗涤后，加depc水能溶解，电泳后跑不出来带，有的点样孔很亮，是怎么回事？另外，是不是rna即使降解了也能跑出smear带？
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1 x$ O8 w3 d, n2 }* O/ 参考见解：
1、 可能是菌体量过大导致Trizol量严重不足，一般为100mg/1 ml Trizol。
2、 存在操作过程中蛋白质残留过多的现象是点样口很亮，用氯仿抽提时，尽量不要吸到蛋白层，为保证RNA 的质量，水层可以稍稍多留点；照片说明RNA在 提取过程中降解了，出现了一片Smear。
2 s+ V* C8 W. P# {0 B3、 导致RNA 降解的原因很多，过滤后的菌体用Pbs清洗后是不是用离心的方法收集的菌体。PBS洗涤后有没有把PBS完全吸尽；没吸尽的话可能导致trizol不能完全把菌体中的RNA酶抑制住从而导致RNA被完全降解。
4、 液氮研磨的时间并不重要，最好是快速而充分的研磨才是最必要的，而且中途不能让其解冻。觉得可以了就马上加trizol 一直研磨直至其变得像润肤霜就可以继续下面步骤了重要的是菌体量和 Trizol加的量有多大，如果Trizol加量相对少，就不能很好的裂解组织和细胞，同时也不能很好的保护RNA,RNA会被RNAase降解掉，所以可以适当增加Trizol的量。
5、 再有操作过程是否规范，最好都是用过滤嘴枪头，最好都是经过depc处理tip and tube 使用一次的橡胶手套，全程带口罩等等细节。至于电泳的问题只要是RNA专用的电泳槽， 电泳槽的问题不大，最主要是在提取的过程中RNA降解了。
阳性菌RNA提取可否用Trizol?是否可用其他试剂?
参考见解：不可以，阳性菌细胞壁含有交联的肽聚糖，Trizol没有这个能力破碎。可以尝试采用超声波破碎再加Trizol提取的方法（一般是加入Trizol后再超声波破碎），或者是研磨破碎再加Trizol，可以根据实验室的条件都做一下，选择其中效果比较好的方法。
做共同叶片RNA提取。在提取RNA后跑电泳后在点样空和28S间总有一段DNA片段的亮带。怎么除去ＤＮＡ污染呢？用的是ＱＩＡＧＥＮ的植物ＲＮＡ提取试剂盒。
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参考见解：反转录的时候第一步加DNase处理: RNA 2ug 加DNase 1ul ,10x buffer 1ul,补DEPC水至10ul.放到PCR仪里37度30min，接着拿出来加stop solution 1ul停止反应 。然后72度10min(这一步是让RNA二级结构打开)以下就进行反转录步骤。
RNA提取中的酚使用的是水饱和酚还是Tris酚？PH值是多大？
( f7 g# `- E) C, [! Y参考见解：RNA提取一定要用酸饱和酚,pH在4.5左右. 水饱和酚是两相的，上层是水。分子克隆上推荐用水饱和酚的。酸性条件下，DNA将进入有机相，可以与RNA分开。
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提取植物病毒的RNA，用于反转录成cDNA，请问下面的试验方案可行吗？存在什么问题？应该怎么样改进？ 1、 称取0.5g病叶，加液氮研磨，迅速转入一支1.5ml的离心管；
2、 加入500ul酚/氯仿和500ul的RNA抽提缓冲液，振荡2min，4度12000rpm离心5min；
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3、 上清用500ul酚/氯仿再抽提一次后4度12000rpm离心5min，加上与上清等体积的4M的Licl（有些资料中说用于反转录的RNA不能用Licl，对吗？），4度沉淀4hr以上； 4、 4度12000rpm离心15min；
5、 沉淀用70％的乙醇洗两次（乙醇是用来沉淀核酸的，此处用来不知何用？）；6、 真空干燥后，沉淀溶于20ulDEPC处理的双蒸水中，－70度保存备用 参考见解：
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1、 平时抽提动物组织中的RNA使用Trizol--Invitrogen公司生产的一种即用型的抽提总RNA的试剂，使用非常方便，在液氮研磨组织时加上Trizol，后面的过程与所写的相差不大，得率高，适合做RT。
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2、 70%乙醇含有一定的水，以其洗涤可以使盐（此处为LiCl)溶解于上清中，从而去掉RNA中的盐分，减少对后续步骤的影响。
. B2 W* ^2 _; j9 ]) V3、 “4度沉淀4hr以上”会不会太久了，太久的话RNA很容易被降解掉。无水乙醇通常用来沉淀RNA/DNA。 4、 实验室做植物病毒RNA的，对常规的方法改进了许多效果特别好。
* _# r3 L( \\- ?6 1) 称取0.15克叶片，放入预冷的玻璃匀浆器中，加入预冷的1ml STE缓冲液和8μl β-巯基乙醇，研磨成匀浆。
2) 转移至离心管中振荡混匀。
3) 加入1ml水饱和酚，1ml氯仿/异戊醇(49:1)，充分混匀，冰浴中放置10分钟，中间混匀2～3次。 4) 台式高速离心机10000rpm，室温离心15分钟。
5) 小心吸取水相，加入1/10体积的3M NaAC (pH 5.2)和等体积的异丙醇，上下颠倒混匀。在－20℃中沉淀3小时。
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6) 台式高速离心机11000rpm，室温离心20分钟，弃去上清。加600μl冰预冷70%的乙醇洗涤沉淀2次，室温干燥15分钟，至乙醇挥发完全为止。
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1 n- B% w0 O9 W- _4 c) R1 M8 U7) 用50μl无菌双蒸水充分溶解提取的RNA。
提RNA，可是电泳后什么条带都没有，用的是REDzol，是因为细胞太少了还是别的什么原因，在加了氯仿后没有出现3层，只有沉淀和上清，是不是因为加氯仿到离心隔的时间太久了？
w9 f% F3 H0 F参考见解： 1、 样品量太小；
2、 操作时没有严格按照提RNA的要求做，一般需要带手套，最好带上口罩，所有塑料用品需要用DEPC处理并高压，要在超净台上操作，尽量不让外源的RNA酶降解RNA。
! Y& q& \\2 S' E3、 RNA电泳的电泳液和胶必须现配现用，并且要用DEPC处理，电泳槽、制胶板先用蒸馏水洗涤然后用75％的酒精处理，还有，要单独一个槽子跑，不要和其他胶一起跑。跑胶时间控制在10分钟左右。
4、 在加了氯仿后没有出现3层，只有沉淀和上清，可能是加的氯仿量不合适，一般是按0.2ml氯仿/mlTrizol
加氯仿的。从加氯仿到离心隔的时间对这个应该没有影响。
5、 在提完RNA后可以测OD值，如果OD值在1.8-2.0之间，说明提的RNA比较纯。
RNA提取可不可以不用DEPC处理，多次灭菌（而不是长时间灭菌）也可以比较有效地灭活RNAse，这种方法确实可行吗？
参考见解：DEPC主要目的是防止RNA酶,其实还有很多其他的方法处理器皿的,如氯仿冲洗,NaOH处理,高温烘烤等另外两次灭菌也可以代替DEPC处理.提RNA的关键在于：防止内源性或外源性RNase降解RNA——对付外源性RNase有两种办法：能烤者烤，能泡者泡。比起其他的核酸实验来说，就多这么一步。其二、RNase分子内部存在二硫键，一般条件变性后很快即可复性，所以极为稳定；而且其作用条件“简单、快捷”——与绝大多数DNase不同，不需要二价阳离子即可迅速发挥酶切作用。所以，要想长期保存RNA标本，DEPC处理溶液、Tip头等都是必不可少的。RNase一般高压不能灭活，如果不用DEPC的话，快速提取，快速使用，不能贮藏。
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3个关于乙醇单词：ethanol；alcohol；mercaptoethanol，他们的主要区别是什么，可以互相代替吗？ 参考见解：ethanol是乙醇的专业名词，是用在医学，工业等方面，主要是指工业酒精。alcohol也是乙醇，酒精的意思，但是主要是用在饮食行业的名词。mercaptoethanol 是巯基乙醇，不同于前两种，是另外一种物质，是一种还原剂。
RNA提取中DNA是怎么去掉的？在哪一步呢？
参考见解：在加入氯仿离心吸取上清的时候，注意不要吸到中间层。一般都要用DNase处理，即使吸不到中间层，也可能有DNA污染。
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3 F+ a1 {! ?+ K 组织已经低温保存了一年多了，用来提RNA可以吗？
参考见解：液氮中保存应该可以，但如果是在-70C低温冰箱中则可能降解，建议在液氮中保存时尽量将组织块切小，最好直径在1CM之内，有利于保存并方便下一步RNA提取操作。当然如果条件允许，可以将组织块放入RNAlater后低温保存，只要普通冰箱即可，方便且效果很好。 怎样能更有效的降低材料的降解？ 参考见解：
1、 新鲜细胞：如果试剂没有问题，且外源性污染也可以排除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如?果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。
3 C4 ^6 h4 U- G* V5 R2、 新鲜组织：某些富含内源核酸酶的样品(如肝脏，胸腺等)，即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。
3、 冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至-70℃冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70℃冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下研磨碎，而直接加入裂解液中匀浆，RNA也比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及时补充液氮。样品研碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。
4、 外源RNA酶的污染：试剂，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。
/ K8 Q2 {; S' K( c# q5、 内源RNA酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高。
3 B8 H$ L, Q) ?- u- yOD260/OD280比值偏低？ 参考见解：
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1、 蛋白质污染：确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，则用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。
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2、 苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。
3、 多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，多糖、多酚含量较多，这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。因此，从这类材料中提取RNA时，需要注意多糖、多酚杂质的去除。
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4、 设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测OD值时，对照及样品稀释液请使用10mM Tris，pH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。 RNA提取得率低？ 参考见解：
8 T: w$ Y( a! ?$ g* F1、 该组织或者细胞中RNA含量偏低：不同细胞和组织中RNA的丰度不同，如肝脏，胰腺，心脏等是高丰度组织(总RNA含量2-4μg/mg)，脑，胚胎，肾脏，肺，胸腺，卵巢等是中丰度组织(总RNA含量0.05-2μg/mg)，膀胱，骨，脂肪等是低丰度组织(总RNA含量<0.05μg/mg)。
2、 组织起始量太少或者太多：样品量过少，则细胞组织中RNA含量较低；样品量过多则可能超过裂解液的裂解能力，裂解将不完全，从而导致RNA得率低。