原来的多态性条带。这种转化成功的标记就称为SCAR标记。由于SCAR标记所用引物长，特异性扩增重复性好，可有效的用于分子育种。 (三)AFLP
它是荷兰Keygene公司科学家Marc ＆ Pieter l993年创造发明的一种DNA分子标记。该技术是对限制性酶切片段的选择性扩增，又称基于PCR的RFLP。鉴于AFLP标记的多态性强，一次可检测到100—150个扩增产物，因而非常适合绘制品种指纹图谱及遗传多样性的研究。
1．AFLP标记的原理 首先对基因组的DNA进行双酶切，其中一种为酶切频率较高的限制性内切酶(frequent cutter)，另一种为酶切频率较低的酶(rare cutter)。用酶切频率较高的限制性内切酶消化基因组DNA是为了产生易于扩增的，且可在测序胶上能较好分离出大小合适的短DNA片段；用后者消化基因组DNA是限制用于扩增的模板DNA片段的数量。AFLP扩增数量是由酶切频率较低的限制内切酶在基因组中的酶切位点数量决定的。将酶切片段和含有与其黏性末端相同的人工接头连接，连接后的接头序列及临近内切酶识别位点就作为以后PCR反应的引物结合位点，通过选择在末端上分别添加1～3个选择性碱基的不同引物，选择性地识别具有特异配对顺序的酶切片段与之结合，从而实现特异性扩增，最后用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物。AFLP的原理示意图见图17—3。AFLP分析的基本步骤可以概括为：
(1)将基因组DNA同时用2种限制性核酸内切酶进行双酶切后，形成分子量大小不等的随机限制性片段，在这些DNA片段两端连接上特定的寡核苷酸接头(oligo nucleotide adapters)。
(2)通过接头序列和PCR引物3'末端的识别，对限制性片段进行选择扩增。一般PCR引物用同位素P或P标记。 (3)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离特异扩增限制性片段。 (4)将电泳后的凝胶转移吸附到滤纸上，经干胶仪进行干胶处理。
(5)在X光片上感光，数日后冲洗胶片并进行结果分析。
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为了避免AFLP分析中的同位素操作，目前已发展了AFLP荧光标记、银染等新的检测扩增产物的手段。
2.AFLP标记的特点 AFLP技术结合了RFLP稳定性和PCR技术高效性的优点，不需要预先知道DNA序列的信息，因而可以用于任何动植物的基因组研究。
AFLP多态性远远超过其他分子标记，利用放射性同位素在变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳可检测到50—100条AFLP扩增产物，一次PCR反应可以同时检测多个遗传位点，被认为是指纹图谱技术中多态性最丰富的一项技术。
AFLP标记多数具有共显性表达、无复等位效应等优点，表现孟德尔方式遗传。
该技术受专利保护，目前用于分析的试剂盒价格较贵，分析成本高；对DNA的纯度及内切酶质量要求也比较高，这也是它的不足之处。 (四)SSR
1987年，Nakamura发现生物基因组内有一种短的重复次数不同的核心序列，他们在生物体内多态性水平极高，一般称为可变数目串联重复序列，简称VNTR(Variable量number tande repeat)。VNTR标记包括小卫星(minisatellites)和微卫星(mierosatellites)标记两种。微卫星标记，即SSR标记，是一类由1～6个碱基组成的基序(motif)串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置(图17—4A)。如(CA)n、(AT)n、(GGC)n、(GATA)n等重复，其中n代表重复次数，其大小在10～60之间。这类序列的重复长度具有高度
变异性。对SSR的研究最早始于动物基因组，特别是人类和哺乳动物基因组研究。目前植物SSR研究也非常活跃。根据基因数据库检索及基因文库杂交筛选，已明确在植物核基因组中，各种SSR数量从大到小依次为(AT)n、An、Tn、(AG)n、(CT)n、(AAT)n、(ATT)n、(GTT)n、(AGC)n、(GCT)n、(AAG)n、(CTT)n、(AATT)n、(TTAA)n、(AAAT)n、(ATTI)n、(AC)n、(GT)n等。
1．SSR标记的原理 尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置上，但其两端的序列多是相对保守的单拷贝序列。根据微卫星DNA两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。一般地，同一类微卫星DNA可分布于整个基因组的不同位置上，通过其重复次数的不同以及重叠程度的不完全而造成每个座位的多态性。SSR标记多态性丰富，重复性好，其标记呈共显性，分散分布于基因组中。
建立SSR标记必须克隆足够数量的SSR并进行测序，设计相应的PCR引物。其一般程序(图17—4A)如下：①建立基因组DNA的质粒文库；②根据欲得到的SSR类型设计并合成寡聚核苷酸探针，通过菌落杂交筛选所需重组克隆。如欲获得(AT)I／(TA)nSSR则可合成G(AT)n作探针，通过菌落原位杂交从文库中筛选阳性克隆；③对阳性克隆DNA插人序列测序；④根据SSR两侧序列设计并合成引物；⑤以待研究的植物DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增反应；⑥高浓度琼脂糖凝胶、非变性或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其多态性。