本实验介绍了小鼠骨髓细胞微核测试和蚕豆根类微核测试技术。 三、实验内容
（一）小鼠骨髓细胞的微核测试
骨髓细胞微核测定的阳性药物可用环磷酰胺，为加强阳性效果，剂量可适当加大。给药途径视实验要求而定。
1. 实验材料
成年小鼠，雌雄均可。 2. 器具和试剂
显微镜、刻度离心管、吸管、载玻片、离心机、注射器、烧杯、解剖器具。环磷酰胺（1mg/ml）溶液、生理盐水、小牛血清（或1%柠檬酸钠溶液）、甲醇、1/15mol/L磷酸缓冲液（pH 6.8）、Giemsa原液。
3. 实验步骤
（1）按40?g/g体重的剂量对小鼠腹腔注射环磷酰胺溶液诱发微核（若进行其它因子测定或自然环境测定按下线步骤直接操作）。
（2）处理24～36小时后，小鼠采用脱颈椎处死，迅速剥取两根股骨，剔净肌肉等软组织，并擦净股骨上的血污。
（3）剪去肌骨两端关节头，用注射吸收2～3ml预温到37℃的生理盐水，然后将针头插入股骨腔，尽量将骨髓细胞冲洗出来，臵于10ml试管中把细胞团用吸管吹打散，然后将细胞悬液转入离心管内，弃去残渣。
（4）1000rpm离心5分钟，收集细胞，弃去上清液，尽量不留残液。滴加2～3滴灭活小牛血清，将细胞轻轻吸打均匀。
（5）1000rpm离心5分钟，收集细胞，弃去上清液，再加1滴灭活小牛血清，用吸管轻轻混匀。
以上两步的小牛血清亦可用1%檬檬酸钠代替，但注意两步须在15分钟内完成。 （6）滴一小滴细胞悬液在清洁的载玻片上，涂成均匀涂片，在空气中干燥。 （7）放入甲醇中固定10分钟，干燥后，用9Giemsa染液（1份原液，9份pH 6.8磷酸缓冲液）染色10分钟，迅速用缓冲液洗片，让其干燥，即可用于观察。
4. 实验结果
选择细胞密度适中，铺展均匀，染色良好的地方，随机观察计数。骨髓细胞中有核的细胞均可见到微核，但是在只有少量胞浆的有核细胞微核细胞常很难与正常核叶及核的突出物相鉴别，而在无核的嗜多染色细胞的胞浆中，微核却易于辨认。因为嗜
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多染色细胞为骨髓细胞中一类主核刚被排出的年幼红细胞，在它完成最后一次有丝分裂后几小时将其主核排出，而由染色体断片形成的微核则保留在细胞中。因此一般观察计数嗜多染色红细胞中的微核。
嗜多染红细胞经Giemsa染色呈灰蓝色，成熟红细胞呈枯红色。微核大多数呈圆形或椭圆形，边缘光将整齐。嗜染性与核质一样，呈紫红色或蓝紫色。每只动物计数1000～2000的嗜多染红细胞，观察含有微核的嗜多染红细胞数，微核率以千分率表示，一个嗜多染红细胞出现一个以上微核，仍按一个细胞计数。
正常小鼠嗜多染红细胞微核率为千分之2.58%+0.41%，即正常小鼠嗜多染红细胞微核率为千分之五以下，超过千分之五为异常。统计你所测定的材料的微核率。
（二）蚕豆根尖微核测定试技术 1. 实验材料
松滋青皮豆。蚕豆根尖细胞的染色体大，DNA含量高，因而是对诱变因子反应敏感的品种。本品种引入后的栽培繁殖时要注意不要同其它蚕豆品种种在一起，不喷洒农药，以保持该品种较低的本底微核值。也可用其它蚕品种，但是必须设臵对照组。种子成熟后，晒于藏干燥器内或4℃冰箱内备用。
2. 器具和药品
显微镜、手动计数器、镊子、载玻片、盖玻片、烧杯、瓷盘。6mol/L盐酸、甲醇、冰醋酸、醋酸洋红、CrO3、NaN3（叠氮化钠）、DMS（甲基磺酸乙醚）。
3. 实验步骤
（1）浸种催芽：将实验用蚕豆按需要量放入盛有自来水（或蒸馏水）的烧杯中，在25℃下浸泡24小时，此间至少换水两次，所换水应25℃预温。种子吸胀后，用纱布松散包裹臵瓷盘中，保持温度，在25℃温箱中催芽12～24小时，待初生根长出2～3mm时，再取发芽良好的种子，放入铺满滤纸的瓷盘中，25℃继续催芽，经约36-48小时，大部分初生根长至1～2cm左右，根毛发育良好，这时即可用来进行检测了。
（2）用被检测液处理根尖，每处理选6～8粒初生根生长良好，根长一致的种子，放入盛有被测液的培养皿中，被测液浸没根尖即可。阳性因子可采用CrO2、NaN3、EMS，为加强阳性效果可适当加大浓度，1.0～2.5mol/L CrO3、0.5～1.5mol/L NaN3和150-220mol/L EMS溶液。另外可取一处污水作被检液之一。用自来水（或蒸馏水）处理作对照。处理根尖12～24小时时，此时间亦可视实验要求和被测液浓度而定。
（3）根尖细胞恢复培养：处理后的种子用自来水（或蒸馏水）浸洗三次，每次2～3分钟。洗净后再臵入铺有湿润滤纸的瓷盘中，25℃下再恢复培养22～24。
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（4）根尖细胞固定：将恢复后的种子，从根尖顶端切下1cm长的幼根，用甲醇：冰醋酸（3：1）液固定24小时。固定后的根如不及时制片，可换入70%的乙醇溶液中臵4℃冰箱中保存备用。
（5）酸解：用蒸馏水浸洗固定好的幼根两次，每次5分钟，吸净蒸馏水，加入6mol/L盐酸将幼根浸没，室温下酸解10分钟，幼根软化即可。
（6）染色：吸去盐酸，用蒸馏水浸没幼根三次，每次1～2分钟。最后浸于水中。制片前了出臵载玻片上，截下1～2mm左右长的根尖，滴一滴醋酸洋红染液，染色5～8分钟，加车盖玻片，压片观察。
4. 实验结果
首先在显微镜低倍镜下找到分生组织区细胞分散均匀，分裂相较多的部位，再转高倍镜观察。微核大小在主核1/3以下，并与主核分离，着色与主核一致或稍浅，呈圆形或椭圆形。每一处理观察3个根尖，每个根尖数1000个细胞，统计其中含微核的细胞数，然后平均，即为该处理的MCN%，即微核千分率，以此可作一个检测指标。
根据你的实验安排列表填出你的实验结果。 若进行污水检测，根据
污染指数（PI）=样品实测MCN%平均值/对照组（标准水）MCN%平均值 鉴定出你所测水样的污染程度，也可以计算被检化学药剂的污染指数。
污染指数在0～1.5区间基本没有污染
1.5～2区间为轻度污染 2～3.5区间为中度污染 3.5以上为重度污染。
四、思考题
1. 试比较动物和植物系统的微核测试方法。
2. 在蚕豆根尖细胞的微核测试中，为什么要进行恢复培养？
3. 产生微核的根尖细胞在产生前的分裂中期可能出现什么样的中期分裂图象？
4. 实验观察中请同时仔细观察每个分裂相细胞。
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实验五 鱼类染色体的快速制备－体内注射PHA法 （自制豆类PHA制备鱼类染色体标本）
—— 选做实验
一、实验目的
1.了解鱼类染色体的形态与数量特征。
2.学习用直接方法制作鱼类染色体标片的方法与技术。 二、实验原理
PHA作为致有丝分裂原在细胞体外短期培养中的广泛应用,使专供鱼类染色体制片的血培养,鳞培养以及肾培养等短期培养方法在二十世纪七十年代建立。但体外培养的实验设备和无菌操作，程序繁琐，耗用时间长，在应用上受限制。 三、实验材料
鲫鱼(200—300g/尾)。 四、实验仪器及用具
显微镜，计时器；染缸，染色板，酒精灯，白绸，镜头纸，培养皿，材料瓶，载玻片，盖玻片，镊子，解剖刀，解剖针，镊子，木夹，吸水纸，标签，铅笔等常用工具。
五、药品和试剂
（1）含PHA的豆类浸提液；（2）0.1%秋水仙素溶液；（3）其余同实验一。 六、实验步骤
1. 含PHA的豆类浸提液制备
称取8g颗粒饱满的豆子，有蒸馏水洗净，纱布吸干，晾干；用粉碎机将豆子粉碎成粉末；把上述豆粉称取10g放入烧杯中，同时加入50ml0.9%氯化钠溶液浸泡过夜，中间摇动几次；再将上述浸液经纱布过滤，去除粗渣后，放在4支离心管里，使离心机以8500转/分离心20分钟，弃去沉淀，上清液就是PHA提取液；可分装入小瓶，贴好标签，在4℃下至少可保存3个月。
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2、注射PHA
自实验鲫鱼（200－300g/尾）胸鳍基部一次注射自制PHA溶液0.5ml～1ml／尾，处理时间为4小时。
3、注射秋水仙素
将实验鱼胸鳍基部一次注射0.02％秋水仙素1ml，处理2小时。 4、断尾失血
将实验鱼断尾失血20min，取肾中前部用生理盐水反复洗涤。 5、制备细胞悬浮液
将肾组织块臵于少量生理盐水（25ml）培养皿中，两手各持一把镊子反复撕拉肾组织，加入5ml（生理盐水，用260目筛绢过滤到15ml离心管。
6、离心洗涤细胞
将滤液800转／min离心5－6min弃上清液，加入生理盐水再离心2次，每次弃上清液。
7、低渗处理
向离心管加入0.6NKCl.1ml制备细胞悬液,静臵数分钟后用吸管吸取悬液滴1－2滴，在培养皿中的载玻片上，然后加1－2ml KCl低渗液进行稀释并用吸管吹打，使细胞均匀铺满整个玻面，盖上培养皿，防止水分蒸发低渗处理30min。
8、固定
凉干玻片后，用吸管滴固定液1－2滴在玻片上，使之分布均匀，让其然干燥后，再滴1－2滴固定液，自然干燥。
9、染色
将固定处理的玻片放在染色液中染色30分钟，自来水冲洗，干燥后显微镜观察。 七 作业
1、PHA和秋水仙素在本实验中的作用分别怎样？ 2、鱼类染色体的有什么样的形态特征？ 3、选择较好的分裂相进行拍照并保存。
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