（二）分析方法 1、荧光分光光度法
2、薄层色谱法：荧光分光光度检测采用氯化镁和三乙胺显色,紫外分光光度检测采用快蓝BB和吡啶显色。 3、毛细管电泳法 4、高效液相色谱法
HPLC法是四环素类药物残留分析最常用的方法, 第五节 磺胺类药物残留的危害分析与检测方法
危害：能引起人的再生障碍性贫血,粒细胞缺乏症等疾病。 吸收后存在形式
游离型具抗菌作用,且能透过毛细血管进入各种体液和组织。
结合型无抗菌活性,也不能透入体液或组织中,但结合较疏松,能不断分解出游离型磺胺。 乙酰化是磺胺的主要代谢产物,无抗菌活性。 化学性质
本类药物水溶性较低,易溶于极性有机溶剂如乙醇、丙酮、乙腈、氯仿和二氯甲烷,难溶于非极性有机溶剂。 生物样品通过多次液-液萃取,可达到净化的目的。 1、提取
液体样品(如牛奶)可用水稀释过滤后,荧光直接检测,亦可用水性缓冲液或氯化钠溶液稀释,再进行净化处理。 组织样品(如肌肉、肾脏、肝脏)的预处理相对复杂些,一般采取均质、液-液萃取或固相萃取净化等步骤。 溶剂提取时,应尽可能使组织中结合态的残留物溶解,并且除去大部分的蛋白质。
一般可采用酸性水溶液、乙腈、氯仿、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮或混合溶剂等极性溶剂进行提取。
二氯甲烷中加入离子对试剂四丁基铵(pH10),对鱼肉和动物组织的提取,发现磺胺二甲氧嘧啶和奥美普林的提取率很高。
另外,提取过程中加入无水硫酸钠可脱去组织样品中的水分,有助于样品的充分提取。 2、净化
净化方法有液-液萃取、固相萃取、基质固相分散、在线痕量富集、液相色谱、在线透析和超临界流体萃取等。 有时为了获得高的净化效果,几种方法相结合应用。
液-液萃取尽管操作烦琐、耗费溶剂,但在所有净化方法中应用最广。
通过调节样液的pH值,使磺胺类药物有选择性地在有机相与水相之间进行分配。 用正己烷或乙醚进行液-液萃取,可以脱脂肪。 固相萃取
由于甲氧苄啶常和其他磺胺药物同时使用,而它们具有不同的pKa和溶剂亲和力,难以在给定的pH值和溶剂系统中同时提取,宜采用固相萃取法(SPE)。
该法操作较为简便、并对生物样品具有较高的“净化”能力,可提高方法的提取回收率和精密度。亦可将几种小柱串联应用,可获得更高的净化效果。
超临界流体萃取法被用于猪肾脏样品中甲氧苄啶和3种类固醇激素的提取分离。 三、分析方法
生物样品中磺胺类药物的分析,光谱法(分光光度法、荧光光谱法)和色谱法（薄层色谱、气相色谱、液相色谱、超临界流体色谱）具有灵敏、快速、方便等优点。 1、光谱法
光谱法主要用于样品中个别磺胺类药物的分析,最常用的方法为重氮化-偶合反应分光光度法。 光谱法选择性差,但可作为一种筛选法应用,如牛奶中磺胺醋酰和磺胺脒啶的筛选测定。 2、薄层色谱法
薄层色谱(TLC)经常作为样品筛选方法。
经薄层色谱分离后的磺胺类药物,可按两种方法进行定量分析：洗脱定量法和薄层扫描定量法。
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3、气相色谱法
气相色谱法(GC)具有高的灵敏度和选择性,但由于磺胺类药物难挥发, 测定时需要衍生化。
一般用重氮甲烷甲基化,或甲基化后再用N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺(MSTFA)进行硅烷化或N-甲基双(三氟乙酰胺)(MBTFA)乙酰化,以增加挥发性,改善色谱特性(热稳定性、降低极性),氢火焰离子化检测器测定。 除了甲基化外,也可利用水解法将磺胺类药物水解成相应的挥发性胺类,继之以GC法测定,
也可与适宜的卤化试剂反应,生成相应的衍生物,如三氟乙酰化或七氟丁酰化衍生物等,以电子捕获检测器测定。
4、高效液相色谱法
流动相中加入适量戊磺酸、己磺酸和辛磺酸离子对试剂,可以改变磺胺类药物的保留时间和改善峰形。
HPLC的洗脱方式,一般采用等度洗脱,若需同时检测数种磺胺类药物或多种代谢物,可采用梯度洗脱,通过改变流动相流速或配比,实现在较短的时间内对生物样品中混合组分或代谢物的分离。
本法选择的流动相为磷酸盐缓冲液(pH7.0)-甲醇(85+15),可分离7种磺胺类药物的混合物。 5、紫外检测器
磺胺类药物在250~290nm波长区间有强的紫外吸收,因此HPLC的在线检测,一般采用紫外检测。
为提高检测灵敏度,可使用对二甲氨基苯甲醛(DMAB) 柱后衍生化,于450nm处紫外-可见光检测,已应用于蛋、奶和肌肉组织中13种磺胺类药物的测定,以及动物组织中6种磺胺类药物的测定。 6、荧光检测器
磺胺类药物本身具有弱的荧光特性,但荧光检测时还需要荧光衍生化。 常用的荧光衍生剂有邻苯二甲醛(OPA)、荧胺和巯基乙醇等。
磺胺类药物与OPA或其衍生物(如4-羟基-邻苯二甲醛)在酸性介质中反应呈现蓝色荧光,检出量可达1× 10-9~8×10-8mol/mL的浓度范围。
荧胺作为荧光衍生剂,可选择性地用于具有脂肪族伯胺基团药物共存时芳伯胺药物的微量测定,其检测限量可达0.8×10-9mol/mL。
衍生化方式有柱前衍生化和柱后衍生化。
第七节 苯并咪唑类药物残留的危害分析与检测方法
本类药物的特点是驱虫谱广,驱虫效果好,毒性低,甚至还有一定的杀灭幼虫和虫卵作用。
苯并咪唑类中的帕苯达唑、坎苯达唑、阿苯达唑和奥芬达唑对妊娠早期(约妊娠三周)绵羊的胎儿有致畸作用,因此用于孕畜时应特别慎重。 样品处理 1、水解
肝和奶样中苯并咪唑类药物与蛋白结合率较高,不易被有机溶剂提取,可先将样品水解后再提取游离的药物。 常用的水解方法有酸水解和酶水解两种。
酸水解通常使用无机酸,例如用4moL/L盐酸于80~110℃ ,在1~4h即可完成水解。
酶水解通常使用β-葡糖苷酸酶或芳基硫酸酯酶,前者可专一地水解葡萄糖醛酸苷结合物,后者可水解硫酸酯结合物。
2、提取及净化
液-液萃取(LLP)是提取苯并咪唑类药物的最常用方法,通常将水性溶液调节至适当的pH值,用水不相溶的有机溶剂提取。
用酸溶液提取时,即包括了样品的水解过程。
由于苯并咪唑类药物的极性和pKa差异很大,因此多残留提取相当困难,即使对单一药物,母药及其代谢产物的同时提取亦难。
(1)血浆、血清或其他生物液体
生物体液样品中的苯并咪唑类可用有机溶剂提取,直接进样分析。自动萃取仪具有省时、省力、重复性高的优点,应用日趋广泛。
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(2)组织
动物组织中的苯并咪唑类提取一般用有机溶剂,并经LLP和SPE净化。 (3)牛奶和奶制品
奶制品相对于组织样品要容易处理些,而且牛奶含更少的色素和内源性干扰物。
牛奶样品一般要脱蛋白和脂肪预处理,再调节溶液pH值,用水不相溶的有机溶剂(如:乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷)来提取,pH值的选择与被测物的种类和数量有关。 三、分析方法
苯并咪唑类药物残留的测定方法主要有生物检测法、分光光度法、薄层色谱法、免疫分析法、气相色谱法和液相色谱法，采用紫外、荧光和质谱检测。 1、生物检测法
生物检测法曾被用来检测食品中苯并咪唑类残留,但现在大部分用来评价驱虫剂的效能。
生物检测法首先用TLC板将残留物分离出来,然后用含培养剂和生物指示剂的溶液喷雾TLC板,TLC板上抑制生物繁殖的区域表明药物残留的存在,抑制区域的大小与残留物的浓度有关。 2、分光光度法
采用分光光度法测定农作物中的BEN残留。 3、薄层色谱法
TLC作为半定量分析方法,适合于食品中苯并咪唑类残留检测的筛选。 4、免疫分析法
免疫分析法是一种简便、灵敏、选择性高的检测方法。
一般情况下,生物样品如血浆、血清、牛奶能够直接测定或者稀释后测定。 早期,放射免疫法被应用于测定动物组织和农作物中的苯并咪唑类残留。 ELISA检测
基于辣根过氧化物酶结合(HRP)的竞争性ELISA法已被用于肝组织提取液以及水果、蔬菜和果汁中TBZ的检测,果汁样品稀释后可直接检测。 5、气相色谱法
只有少数苯并咪唑类药物(如:TBZ、5-OH-TBZ)可直接用GC法分析。
大部分苯并咪唑类药物极性较高,难以气化,热稳定性差,故GC法分析需要衍生化。 6、液相色谱法
HPLC法被广泛应用于动物组织中苯并咪唑类残留的分析,通常采用反相柱如C18、C8柱分离,也有采用正相柱如uBondapak NH2柱分离。
第八节 激素类药物残留的危害分析与检测方法 兽用激素包括皮质激素、同化激素
第七章 其他化学性污染的危害与检测
食品加工过程产生：二噁英、多氯联苯、亚硝胺、多环芳烃、杂环胺、食品添加剂
1、二噁英类化合物：一类氯代含氧三环芳烃类化合物，强致癌、免疫毒性、生殖毒性。 2、多氯联苯类化合物：含氯的联苯化合物，致癌、生殖毒性、神经毒 3、亚硝胺类化合物：亚硝酸盐转化，致癌。
4、多环芳烃类化合物：代表物为苯并芘，熏烤食物中。致癌。
5、杂环胺类化合物：含蛋白质较丰富的食物高温烹调时易产生，尤其是与明火直接接触或与灼热金属表面接触会提高环胺类的生成量。致癌。
6、食品添加剂引起的毒害：代谢转化产物的毒性（糖精在体内转化成环己胺）、杂质的毒性（森永砷乳）、营养性添加剂过量的毒性（维生素A、D）、添加剂引起的过敏反应（柠檬黄引起哮喘）。
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第一节 二噁英类化合物的危害分析与检测方法 一、定义
二噁英类化合物是指那些能与芳香烃受体结合,并且导致产生各种生物化学变化的一大类物质的总称。包括：多氯代二苯并-对-二噁英(PCDDs)和多氯代二苯并呋喃(PCDFs)。其中研究最多也是最典型和毒性最强的物质是2,3,7,8-四氯代二苯并-对-二噁英 存在形式：主要以混合物形式存在。 二、理化性质
所有二噁英化合物皆为固体,均具有很高的熔点和沸点,蒸气压很小,大多不溶于水和有机溶剂,但易溶于油脂,易被吸附于土壤、沉积物和空气
中的飞尘上,具有较高的热稳定性、化学稳定性 结构 和生物化学稳定性,一般加热到800℃才能分解。在环境中的自然降解很慢,半衰期约为9年。 *三、危害：
二噁英 (Dioxin),又音译为戴奥辛 ,是多氯甲苯和多氯乙苯类有机化学品的俗称 ,因其毒性是氰化钠的 130倍、砒霜的 900倍 ,故被称为“毒中之毒”。损害免疫系统、生殖系统及强致癌性。自然界中不存在天然的二噁英。二噁英完全是由于人为污染造成的。 1、致死作用与废物综合征 二噁英可以使动物中毒死亡。
*中毒特点为染毒几天内出现肌肉和脂肪组织总量急剧减少,体重严重下降,这些反应称为废物综合征
2、致癌性（Ⅰ类致癌物） 3、氯痤疮
二噁英毒性的一个特征标志是氯痤疮,主要表现为皮肤发生增生或过度角化、色素沉积,出现痤疮,并伴有胸腺萎缩及废物综合征。仅在高剂量时发生。 4、肝脏毒性
二噁英肝中毒者以肝脏肿大、实质细胞增生与肥大为共同特征。 5、胸腺萎缩及免疫毒性
二噁英可引起实验动物胸腺萎缩,主要以胸腺皮质中淋巴细胞减少为主。人类胸腺也是二噁英敏感器官
6、生殖毒性和致畸性
卵巢功能障碍、抑制雌性激素、睾丸形态改变，精子退化,数量减少、致畸性 三、污染来源
1、环境中的二噁英：①含氯化合物的生产和使用②垃圾、污泥的焚烧③煤、石油、汽油、沥青等的燃烧④含除草剂的枯草残叶的燃烧及森林大火也会产生二噁英。⑤意外事故和战争（变压器的泄露和意外爆炸）
一旦摄入二噁英就很难排出体外，积累到一定程度，它就引起一系列严重疾病。
2、食品中的二噁英：环境中二噁英进入食物链，造成食品原料污染；食品中的二噁英也可能来源于食品加工、包装、储存等过程以及意外事故。①生物富集（食物链）②食品加工与包装③意外事故
评价PCDD/Fs对人体危害的指标
? 需要根据PCDD/Fs的大量生化和毒理学数据,计算出各个同分异构体与
2,3,7,8-TCDD的毒性剂量的比值,此比值即为毒性当量因子(TEF)。 ? TEQ指的是毒性当量(值),是衡量多种化合物的综合毒性的一个指标,利用TEF可以
计箅出样品中PCDD/Fs所有异构体的综合毒性,即毒性当量(TEQ)。 9
四、二噁英类化合物检测的定量方法及特点 定量方法:
总含量=毒性当量(TEQ)
∑(二噁英类化合物各种同系物在样品中的含量x其相应的毒性当量因子TEF) 五、二噁英的分析检测
? 二噁英的分析方法很多,其定性定量最常使用的方法是高分辨率气相色谱-质谱法。 色谱法:提取→净化→测定→定性→定量 免疫法:二噁英可被受体特异性识别并结合
生物法:二噁英能在体外细胞培养中转化为特殊生物信号。这种方法是根据二噁英类化学物质的毒性机理。二噁英类化学物质的毒性作用主要通过与体细胞内芳香烃受体相结合，然后结合物转移细胞核,再通过蛋白质表达出来。 饲料中二噁英类化合物的检测
气相色谱-质谱法、免疫学和生物学检测法 、酶免疫分析(EIA)法、时间分辨荧光免疫分析(DEIFIA)法、化学激活荧光表达(CALUX)法 、化学激活荧光基因表达(CAFLUX)法 、7-乙氧基异吩恶唑酮-脱乙基酶(EROD)法 、PCR技术 、蛋白标记分析 第二节 多氯联苯的危害分析与检测方法
一、结构C(12) H(10 – X) Cl (X)，X 为H或Cl 二、污染来源
PCBs的主要污染来源是生产和使用多氯联苯的工厂向环境中排放含PCBs的废水和倾倒含PCBs的废物。 三、危害
PCBs对环境的危害
最容易富集在海洋鱼类和贝类食品中。
三大類世紀之毒：多氯聯苯、含氯氧化聯苯（如戴奧辛/二噁英 ）、有機氯殺蟲劑（如DDT）
对人体：致癌性、生殖毒性、神经毒性、干扰内分泌系统 四、多氯联苯的检测方法
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 颁布：GB/T 24165-2009 采用气相色谱-质谱法(GC-MS)或气相色谱法-电子捕获检测器(GC-ECD)对商品染料、染料制品、染料中间体和纺织印染助剂中多氯联苯的测定。
国家环境保护局 颁布： GB 13015-91废物中多氯联苯（PCB）的测定：多氯联苯的物理化学性质与有机氯农药相似，在气相色谱测定时互相干扰，因此，采用气相色谱法定量，薄层色谱法进行确证试验。 原理
多氯联苯具有高度的脂溶性,用有机溶剂萃取时,同时提取多氯联苯和有机氯农药,经色谱分离之后,可用带电子捕获检测器的气相色谱仪分析。 第三节 多环芳烃化合物的危害分析与检测方法
1、多环芳烃(PAHs)是指由两个以上苯环连在一起组成的一类化合物。 苯并（a）芘
2、性质：常见的多环芳烃类大多由4~7个苯环组成。三环以上的多环芳烃一般为无色或淡黄色结晶,个别颜色较深;熔点和沸点较高,蒸气压很小;多环芳烃溶液具有一定荧光;在光和氧的作用下可很快分解变质,理化性质随之发生改变,致癌力也明显下降。 3、由于脂溶性，容易快速进入体内。含脂肪的组织器官都有分布。在肾脏、肝脏、脂肪组织分布较多，脾脏、肾上腺和卵巢有少量
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