第十二章 微生物的进化、系统发育和分类鉴定?
地球大约是在45亿年前形成的。地质学、古生物学和地球化学直接或间接证据都表明：大约在地球形成10亿年之后，我们这个星球开始出现生命，主要是些类似简单杆状细菌的原始生物。但在同期的、另外一些被认为是由光合微生物与沉积物形成的片层状化石--叠层石(stromatolites)资料中，也发现存在形态较多样的微生物，综合分析认为，它们类似于绿硫细菌和多细胞丝状绿菌，这似乎表明：不产氧光合细菌的起源也很早。这些原始生命大概都是厌氧型的。含有产氧型光合细菌--蓝细菌的叠层石则发现于25-30亿年前的地质年代中 ，蓝细菌的出现，给地球带来了氧气。而后，各种真核生物才随之出现。
根据现代生物进化论观点，地球上的生命是在地球历史早期的特殊环境条件下，通过\前生命的化学进化\过程，由非生命物质产生的。这些最原始的生命经过漫长的进化历程，产生了千姿百态的生物种类。所谓进化(evolution)是生物与其生存环境相互作用过程中，其遗传系统随时间发生一系列不可逆的改变，在大多数情况下，导致生物表型改变和对生存环境的相对适应。所以，今天仍生存在地球上的生物种类，彼此之间都有或远或近的历史渊源。 研究微生物的系统发育(phylogeny)就指的是研究各类微生物进化的历史。
地球上到底有多少物种至今仍无准确答案，估计有分类记录的各类物种大约有150万，其中微生物超过10万种，而且其数目还在不断增加。微生物学工作者要认识、研究和利用微生物或控制有害微生物，必须对它们进行分类(classification)。对生物进行分类存在两种基本的、截然不同的分类原则：一是根据表型(phenetic)特征的相似程度分群归类，这种表型分类重在应用，不涉及生物进化或不以反映生物亲缘关系为目标；第二种分类原则是要按照生物系统发育相关性水平来分群归类，其目标是探寻各种生物之间的进化关系，建立反映生物系统发育的分类系统。从进化论诞生以来，生物分类要反映生物之间的亲缘关系，已经成生物学家普遍接受的分类原则。因此，以进化论为指导思想的分类学(taxonomy)，其目的已经不仅仅是物种的识别和归类，其主要目标是通过追溯系统发育，推断进化谱系，这样的分类学也称之为生物系统学(systematics)。传统的微生物分类方法，主要是根据表型的(形态学 、生理生化学、生态学等)特征来推断微生物的系统发育。分子生物学的发展，使我们不仅可以根据表型特征，而且可以从分子水平上，通过研究和比较微生物乃至整个生物界的基因 型特征来探讨生物的进化、系统发育和进行分类鉴定。
第一节 进化的测量指征
在以往有关进化的教科书中，当讨论生物进化关系时，主要是涉及高等动植物的进化，有关微生物(特别是细菌)的进化则很少触及。之所以出现这种情况，是因为70年代以前，生物类群间的亲缘关系主要是根据形态结构、生理生化、行为习性等表型特征以及少量的化石资料来判断它们之间的亲缘关系。而对于原核生物，由于其形体微小、结构简单、缺少有性繁殖过程，化石资料更是凤毛麟角、即使有也难深入分析，所以，尽管微生物分类学家也根据少量 表型特征来推测各类微生物的亲缘关系而提出过许多分类系统，但都随着时间的推移而不断地被否定了。直到60-70年代，有识之士才清醒地认识到；仅依靠表型特征无法解决微生物的系统发育问题，必须寻找新的特征作为生物进化的指征。
一、进化指征的选择
要按照生物的亲缘关系进行系统分类，使分类系统真正成为总结生物进化历史的生物系谱， 需要系统的古生物资料来阐明各类生物之间的共祖、分支和年代关系。因此，在缺乏化石资料的情况下，最为艰难的任务是如何确定类群之间的进化关系，用什么特征作为划分类群的主要特征? 过去根据形态学特征推断生物之间的亲缘关系存在两个突出问题：一是由于微生物可利用的形态特征少，很难把所有生物放在同一水平上进行比较；二是形态特征在不同类群中进化速度差异很大，仅根据形态推断进化关系往往不准确。因此，70年代以后研究微生物的系统发育，主要是分析和比较生物
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大分子的结构特征，特别是蛋白质、RNA和DNA这些反 映生物基因组特征的分子序列，作为判断各类微生物乃至所有生物进化关系的主要指征。
大量的研究表明；蛋白质、RNA和DNA序列进化变化的显著特点是进化速率相对恒定，也就是说，分子序列进化的改变量(氨基酸或核苷酸替换数或替换百分率)与分子进化的时间成正比 。因此，这些生物大分子被看作是分子计时器(molecular chronometers)或进化钟(evoluti onary clock)，它们真实地记录了各种生物的进化过程。因此，我们可以通过比较不同类群的生物大分子序列的改变量来确定它们彼此系统发育相关性或进化距离。在两群生物中，如果同一种分子的序列差异很大时，表示它们进化距离远，这两群生物在进化过程中很早就分支了。如果两群生物同一来源的大分子的序列相同，说明它们处在同一进化水平上。
为了准确确定各种生物之间的进化关系，还必须挑选恰当的大分子来进行序列研究。在挑选大分子时应注意以下几点：
(1)它必须普遍存在于所研究的各个生物类群中。如果我们所研究的是整个生命界的进化，那么所选择的分子必须在所有生物中存在，这样才便于分析和比较。
(2)选择在各种生物中功能同源的大分子。催化不同反应的酶的氨基酸序列或者具有不同功能核酸的核苷酸序列不能进行比较，因为功能不相关的分子也意味着进化过程中来源不同，对这一类不相关分子进行比较也不期望它们会表现出序列的相似性。所以，大分子进化的研究必须从鉴定大分子的功能开始。
(3)为了鉴定大分子序列的同源位置或同源区，要求所选择的分子序列必须能严格线性排列，以便进行进一步的分析比较。
(4)还应注意根据所比较的各类生物之间的进化距离来选择适当的分子序列。当我们比较亲缘关系远的生物类群时，必须选择变化速率低的分子序列，因为序列变化速率高的分子，在其进化过程中共同的序列已经丧失。大量的资料表明：功能重要的大分子、或者大子中功能重要的区域，比功能不重要的分子或分子区域进化变化速度低。
二、rRNA作为进化的指征?
虽然蛋白质、RNA和DNA等生物大分子都可以提供生物进化的信息，但并不等于所有各类大分子都广泛适用于生物系统发育的研究，大量的实验研究表明：在众多的生物大分子中，最适合于揭示各类生物亲缘关系的是rRNA，尤其是16SrRNA。16SrRNA所以被普遍公认为是一把好的谱系分析的\分子尺\，这是因为：
(1)rRNA参予生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中，其功能保持不变；
(2)在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究；
(3)16SrRNA分子量大小适中，便于序列分析。在5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA三种分子中，5SrRNA约含120个核苷酸，虽然它也可以作为一种信息分子加以利用，但由于其信息量小，应用上受很大限制。23SrRNA虽然它蕴藏着大量信息，但由于分子量大(约含2900个核苷酸)序列测定和分析比较工作量大，使用时难度较大。而16Sr RNA分子量大小适中(约含1540个核苷酸)，含有足以广泛比较各类生物的信息量，加上rRNA 在细胞中含量大(约占细胞中RNA的90%)也易于提取；
(4)16SrRNA普遍存在于真核生物和原核生物中(真核生物中其同源分子是18SrRNA)。因此它可以作为测量各类生物进化的工具。这一点极为重要，在70年代以前，生物进化的研究之所以没有取得突破性进展，重要原因就是没有找到一把可以测量所有生物进化关系的尺子。这把\尺子\是美国学者伍斯(Carl Woese)70年代首先发现的，他用这把尺子对微生物系统发育进行了开拓性研究，发现了生命的第三种形式* --古细菌(见5.)。
* Michael W.Gray, 1996, The third form of life, Nature, 383:299. 三、rRNA的顺序和进化
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用rRNA分子计时器进行微生物进化关系的分析，需要对所比较的微生物进行培养，然后提取并纯化rRNA，进行rRNA序列测定，获得各相关微生物的序列资料，然后输入计算机进行分析比较，由计算机分析微生物之间系统发育关系。rRNA序列测定和分析方法分两类：寡核苷酸编目法和全序列分析法。
1. 寡核苷酸编目分析法?
八十年代中期以前的研究，主要是采用寡核苷酸编目分析法。序列测定的大致的做法是：将纯化的16SrRNA用核糖核酸酶(如T1核酸酶)处理，水解成片断，并用同位素体外标记(也可以在培养微生物时进行活体标记)，然后用双向电泳层析法，分离这些片断，用放射自显影技术确定不同长度的寡核苷酸斑点在电泳图谱中的位置，根据寡苷酸在图谱中的位置，小片断的寡核苷酸分子序列即可确定。对于不能确定序列的较大片断核苷酸，还需要把斑点切下，再用不同核糖核酸酶或碱水解进行二级分析，有的可能还要进行三级分析，直至弄清所有片断的序列为止。在此基础上，对6个或更多核苷酸的片断按不同长度进行编目。将所有要比较的微生物的序列目录编好后，即可对这些序列目录资料进行分析比较，采用相似性系数法和序列印记法比较各微生物之间的亲缘关系。?
相似性系数法，是通过计算相似性系数SAB值来确定微生物之间的关系。A和B两菌株的相似性系数SAB =2×NAB /NA +NB，其中NAB代表两菌所含相同寡核苷酸的碱基总数，NA和NB分别代表两菌寡核苷酸所含碱基总数。如果SAB等于1，说明所比较的两菌株rRNA序列相同，是同一进化时间的微生物，若SAB值小于0.1两菌亲缘关系很远。序列印记法，则是通过序列比较后，若发现某些序列仅为某种(群)微生物所特有，这些序列即可作为该种(群)微生物的印记序列(signature sequence)。印记序列通常出现在某一特定系统发育群的全部成员或绝大多数成员中，所以，它可以作为该系统发育群的标志，印记序列对于把微生物归入适当类群，或用来制备核酸探针鉴定微生物有重要意义。伍斯70年代末发现古生菌，认为生命应分三界的理论，就是采用寡核苷酸编目分析对大量的微生物进行分析比较后提出来的(图12-1)。?
图12-1 三界生物的16SrRNA的比较
2.全序列分析法?
寡核苷酸编目分析法，只获得了16SrRNA分子的大约30%的序列资料，加上采用的是一种简单相似性的计算方法，所以其结果有可能出现误差，应用上受到一定限制。随着核酸序列分析技术的发展，八十年代末又陆续发展了一些rRNA全序列分析方法，其中最常用的是直接序列分析法。这种方法用反转录酶和双脱氧序列分析，可以对未经纯化的rRNA抽提物进行直接的序列测定。其大致的做法如下：抽提细胞总rRNA，用少量与16SrRNA分子中某些高度保守区内的碱基序列互补的DNA寡核苷酸(约15～20个核苷酸)作引物与其混合，然后加入反向转录酶和32P标记的双脱氧腺三磷酸和其他三种未标记的脱氧核苷酸混合，并分成四等份，往每一份中分别加入少量四种不同的2,3双氧脱核苷酸。反转录酶解读rRNA中的16SrRNA模板，并复制DNA拷贝，通过双脱氧核苷酸类似物的随机结合中止在不同位点上的转录。最后用电泳法分离所产生的DNA片断(在四个反应体系中DNA片断，都分别以A、G、C、T 结尾)。根据四个反应体系DNA片断在电泳凝胶上的排列，用放射自显影技术解读互补DNA顺 序，从而推断出16SrRNA顺序。更新的序列分析技术是用人工合成的与16SrRNA保守区内的序 列互补的寡核苷酸作引物，用PCR技术来扩增16SrRNA的基因(编码16SrRNA的DNA)，再用类似上述方法的双脱氧序列分析法进行直接的序列分析。这种方法用的细胞材料少，适于开展大规模研究。
为了使16SrRNA全序列测定所获得的序列资料，能准确反映各生物之间的进化关系，在比较这些原始序列资料之前，应用计算机先将这些rRNA序列资料进行排序，使各个生物的16SrRN A序列
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的同源位点一一对应，顺序排列(以保证各生物之间的比较，不仅是同源分子的比较，而且是同源位点的比较)，然后两两进行比较，统计两序列之间异同序列数值，用相似性系数(类似编目分析的SAB)或距离数据来表示各微生物之间的进化关系。无论是相似性系数或是表示距离的数据，都是表示存在于两个线性大分子之间的不同位点的数量指征。值得强调的是：当把序列的异同资料转化为反映微生物之间的真实的进化距离(evolutionary distance)时，要考虑到大分子在进化过程中可能发生回复突变或重复置换等所造成的误差 ，因而常用统计学方法对原始数据进行校正，以便能真实反映生物之间的亲缘关系。
在对全rRNA序列资料进行分析比较时，印记序列无疑也是确定微生物进化关系的重要特征， 而且在全序列的顺序资料中，除了可能出现由多个核苷酸组成的印记序列外，还可能在某些特定的序列位点上出现单碱基印记。单碱基印记作为\有可能\属于某一特定类群的标记， 它可以揭示我们在作进一步研究的基础上，迅速确定某种微生物的分类地位。有关界定三域 生物的16S或18SrRNA的印记序列及单碱基印记见表12-1。
表12-1 古生菌、细菌和真核生物的16S(18S)RNA的印记序列
出 现 的 百 分 数 寡核苷酸印记 CACYYG CYAAYUNYG AAACUCAAA AAACUUAAAG NUUAAUUCG YUYAAUUG CAACCYYCR UUCCCG UCCCUG CUCCUUG UACACACCG CACACACCG 单碱基印记 U A U 549 675 880 大致的位置 古生菌(古细菌) 315 510 910 910 960 960 1110 1380 1380 1390 1400 1400 98 0 0 0 0 3 100 0 100 0 0 >95 >95 0 100 0 100 2 细菌(真细菌) ＞95 ＞95 100 0 >95 <1 >95 >95 0 0 >99 0 0 2 100 真核生物 0 0 0 100 0 100 0 0 100 0 100 0 ? 注：① Y=任何嘧啶；R=任何嘌呤；N=任何嘌呤或嘧啶? ② 印记序列的位置以大肠杆菌 16SrRNA作参考。
四、系统发育树
图12-2 系统树
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在研究生物进化和系统分类中，常用一种树状分枝的图型来概括各种(类)生物之间的亲缘关系，这种树状分枝的图型被称为系统发育树(phylogenetic tree)，简称系统树。通过比较生物大分子序列差异的数值构建的系统树称为分子系统树。图型中，分枝的末端和分枝的连结点称为结(node)，代表生物类群，分枝末端的结代表仍生存的种类。系统树可能有时间比例，或者用两个结之间的分枝长度变化来表示分子序列的差异数值。系统树分无根树(unroo ted tree)和有根树(rooted tree)两种形式。无根树只是简单表示生物类群之间的系统发育关系，并不反映进化途径。如图12-2a的上图，只简单表示在A、B、C和D四种生物中，A与B比它与C或D的关系更亲近。而有根树(图12-2b)中，不仅表示出A、B、C、D的亲疏，而且反映出它们有共同的起源及进化方向。构建有根的系统树是相当困难的，如上述假设的简单例子中，连结4种生物的无根树只有3种可能，而有根树则存在15种可能的连结方式，图12-2分 别代表其中的两种连接方式。
构建分子系统树，是在进行序列测定获得原始序列资料后，由计算机排序，使各分子的序列同源位点一一对应，然后计算相似性或进化距离。在此基础上，使用适当的计算机软件根据各微生物分子序列的相似性或进化距离构建系统树。计算机分析系统发育相关性构建系统树时，可以采用各种方法，其中常用是最节省分析法或称简约法(parsimony analysis)。这种方法推断谱系的原则是：在所有可能的谱系关系中，涉及进化改变的序列特征数最少的谱系是最可信的。因此，在比较过程中要找到比较决定性的序列。这种分析方法是基于这样一种假定：进化变化的发生，是沿着最短的途径、发生最少的、变化从祖先进化成今天所比较的生物种类。
1981年伍斯等根据某些代表生物16SrRNA(或18SrRNA)序列比较，首次提出了一个函盖整个生命界的系统树，而后又进行了多次修改和补充，图12-3就是近年提出的一个全生命系统树， 该系统树勾画了生物进化的大致轮廓。从图中可以看出，这是有根的树，根部的结代表地球上最先出现的生命，它是现有生物的共同祖先，生物最初的进化就从这里开始。rRNA序列分析表明，它最初先分成两支：一支发展成为今天的细菌(真细菌)；另一支是古生菌--真核生物分支，它进化过程中进一步分叉分别发展成古生菌和真核生物。因此，从该系统树所反映的进化关系，表明古生菌和真核生物属\姊妹群\，它们之间的关系比它们与真细菌之间的关系更密切。从该系统树还可以看出，古生菌分支的结点离根部最近，其分支距离也最短， 这表明它是现存生物中进化变化最少、最原始的一个类群。真核生物则离共同祖先最远，它们是进化程度最高的生物种类。
图12-3 全生命系统树(Olsen和Woese 1993)
五、三界生物的主要特征
根据形态和生理特征把地球上的生物分为动物界和植物界的理论，统治了生物学100多年，60年代末主要根据细胞核的结构把生物分为原核生物和真核生物两大类，也得到了生物学界的普遍认同。除此之外，在近代还有人提出过诸为三界、四界、五界和六界的生物分类系统。这些系统虽然分类不同，但分类的基本依据却是一样的，即以生物整体及细胞形态学特征和某些生理特征作为推断生物亲缘关系的指征。直到70年代末，这个分类原则才受到伍斯 研究工作的挑战，他用寡核苷酸序列编目分析法对60多株细菌的16SrRNA序列进行比较后，惊奇地发现：产甲烷细菌完全没有作为细菌特征的那些序列，于是提出了生命的第三种形式--古细菌(archaebacteria)。随后他又对包括某些真核生物在内的大量菌株进行了16Sr RNA(18SrRNA)序列的分析比较，又发现极端嗜盐菌和极端嗜酸嗜热菌也和产甲烷细菌一样， 具有既不同其他细菌也不同于其核生物的序列特征，而它们之间则具有许多共同的序列特征。于是提出将生物分成为三界(Kingdom)(后来后改称三个域)：古细菌、真细菌( Eubacteria)和真核生物(Eukaryotes)。1990年，他为了避免把古细菌也看作是细菌的一类 ，他又把三界(域)改称为：Bacteria(细菌)、Archaea(古生菌)和Eukarya(真核生物)。并构建了三界(域)生物的系统树(图12-3)。
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