复杂样本中氨基酸临床、科研和工业生产，将有助于提高氨基酸检测质量、促进检测方法标准化和规范化。 发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一种高灵敏和高通量的30种氨基酸同时定量检测试剂盒，以满足临床检验、工业生产和科学研究等对氨基酸定量检则的需要。
[0008] 本发明的另一目的在于提供上述试剂盒的制备方法。 [0009] 技术方案
[0010] 本试剂盒是一种采用LC-MS/MS测定复杂样本中30种氨基酸(精氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天门冬氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、缬氨酸、甘氨酸、酪氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、Y-氨基丁酸、丝胺酸、牛磺酸、脯氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、α-氨基正丁酸、肌氨酸、δ-羟基赖氨酸、羟基脯氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、焦谷氨酸)浓度的新型试剂盒。复杂样本中氨基酸经有机溶剂提取处理后采用甲醇沉淀并加入稳定同位素标记的氨基酸内标，用盐酸正丁醇为衍生化试剂进行处理，吹干复溶后上清液进行LC-MS/MS检测，记录氨基酸和内标的峰面积。根据氨基酸对应稳定同位素内标浓度、样本中的氨基酸/对应同位素内标峰面积比值即可计算出每种氨基酸的浓度。测定结果为复杂样本中氨基酸浓度。
[0011] 本发明的试剂盒制备过程包括如下步骤:
[0012] 1.稳定同位素内标冻干粉:12种稳定同位素标记氨基酸对照品冻干粉(含2H4 ;5-13C-精氨酸、2H3-亮氨酸、2H3-甲硫氨酸、13C6-苯丙氨酸、2H3-天门冬氨酸、2H2-瓜氨酸、2H3-谷氨酸、2H8-缬氨酸、13C6-酪氨酸、2H4-丙氨酸、2H3-鸟氨酸均0.5pmoL ;含15N ；2-13C-甘氨酸2.5pmoL),贴签标记,完成操作。
[0013] 2.质控样本A的配制:精密称取IOmg精氨酸对照品，置IOmL容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，配制成Img.mL—1的精氨酸储备液。精密量取精氨酸储备液871 μ L，置50mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成17.42 μ g.πιΓ1的精氨酸(lOOymol/L)质控样本，分装，贴签标记，完成操作。
[0014] 3.质控样本B的配制:精密称取IOmg苯丙氨酸对照品，置IOmL容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，配制成Img.mL—1的苯丙氨酸储备液。精密量取苯丙氨酸储备液413 μ L,置50mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成8.26 μ g *mL_1的苯丙氨酸(50 μ mol/L)质控样本，分装，贴签标记，完成操作。
[0015] 4.衍生化试剂组分A:色谱纯正丁醇，分装，贴签标记，完成操作。 [0016] 5.衍生化试剂组分B:12mol/L盐酸，分装，贴签标记，完成操作。
[0017] 6.流动相调节液A的配制:色谱纯甲酸，分装，贴签标记，完成操作。
[0018] 7.流动相调节液B的配制:色谱纯七氟丁酸，分装，贴签标记，完成操作。
[0019] 本发明的试剂盒使用方法如下:
[0020] 取10 μ L样本置于1.5mL EP管中，加入日常工作液100 μ L，13200r/min离心2min。将离心后的上清液直接转移到另一 1.5mL EP管中，氮气保护下50°C吹干，加入60 μ L衍生化试剂，密封，涡旋30s，瞬时离心，65°C孵育15min进行衍生化。衍生后的溶液再次瞬时离心，在氮气保护下5011C吹干。加入100 μ L复溶液复溶,润旋30s, 13200r/min离心2min,进样5 μ L进行LC-MS/MS分析。 [0021] 有益效果
[0022] 本发明试剂盒采用LC-MS/MS同时定量检测复杂样本中30种氨基酸的浓度，建立了一种高灵敏度(pmol级)和准确性的30种氨基酸LC-MS/MS定量方法，同分异构体基本都能基线分离，方法操作简单、快速、高通量，可用于临床检验、工业生产和科学研究中样本的检测。同时，本发明试剂盒首次实现多种氨基酸LC-MS/MS定量检测技术国产化，它的推广应用将有助于提氨基酸检测质量、促进检测方法标准化和规范化。
附图说明
[0023] 图1氨基酸样本处理和检测过程[0024] 图230种氨基酸总离子流图
[0025] 图3氨基酸同分异构体基线分离图 具体实施方式 [0026] 1、适用仪器
[0027] 液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)，配备电喷雾离子源(ESI)。 [0028] 2、样本要求
[0029] 血浆样本:采集静脉全血样本，置于抗凝管中，采血后立即颠倒混匀5?6次，于30min以内离心分离血浆，_20°C冰冻保存待测。 [0030] 尿样、脑脊液:取样后直接-20°C冰冻保存待测。
[0031] 组织样本:生物组织或研磨或匀浆处理并用有机溶剂充分提取后，高速离心取上清液，用提取试剂稀释到合适的浓度，-20°C冰冻保存待测。
[0032] 其它需测定游离氨基酸的样本:充分溶解或浸泡后，用甲醇水(I: lv/v)充分提取，高速离心取上清液，用提取试剂稀释到合适的浓度，-20°C冰冻保存待测。
[0033] 其它需测定全部氨基 酸的样本:称取一定量样本，加入适量的盐酸^mol/L)，密封，110°C高温水解24h，水解完自然冷却后，取出水解液过0.45 μ m水系滤膜。所得滤液取一定量在50°C下氮气吹干，用甲醇水(I: lv/v)复溶并稀释到合适的浓度，-20°C冰冻保存待测。 [0034] 3、检验前准备
[0035] 浓缩储备液的配制:取“稳定同位素内标冻干粉”用2mL甲醇充分溶解，混匀，即为浓缩储备液，分装，密封4°C保存待用，使用效期I个月。
[0036]日常工作液的配制:取浓缩储备液，甲醇稀释100倍，分装，密封4°C保存待用，使用效期I周。
[0037] 衍生化试剂的配制(盐酸正丁醇):衍生化试剂组分A-衍生化试剂组分B (95: 5v/v)，混匀，密封4°C保存待用。
[0038] 复溶液的配制:乙腈-水(4: lv/v)，混匀，密封4°C保存待用。 [0039] 4、检验方法 [0040] 全血样本前处理:
[0041] 取10μ L样本置于1.5mL EP管中，加入日常工作液100 μ L，13200r/min离心2min。将离心后的上清液直接转移到另一 1.5mL EP管中，氮气保护下50°C吹干，加入60 μ L衍生化试剂，密封，涡旋