拉曼光谱法指导原则
拉曼光谱法是研究化合物分子受光照射后所产生的散射，散射光与入射光能 级差和化合物振动频率、转动频率的关系的分析方法。
与红外光谱类似，拉曼光谱是一种振动光谱技术。所不同的是，前者与分子 振动时偶极矩变化相关，而拉曼效应则是分子极化率改变的结果，被测量的是非 弹性的散射辐射。
拉曼光谱通常采用激光作为单色光源，将样品分子激发到某一虚态，随后受 激分子弛豫跃迁到一个与基态不同的振动能级，此时，散射辐射的频率将与入射 频率不同。这种频率变化与基态和终态的振动能级差相当。这种“非弹性散射” 光就称之为拉曼散射。频率不变的散射称为弹性散射，即所谓瑞利散射。如果产 生的拉曼散射频率低于入射频率，则称之为斯托克散射。反之，则称之为反斯托 克散射。实际上，几乎所有的拉曼分析都是测量斯托克散射。
拉曼光谱与红外吸收光谱相似。用散射强度对拉曼位移作图。拉曼位移（以 cm-1 为单位）等于激发光的波数减去散射辐射的波数。由于功能团或化学键的拉 曼位移与它们在红外光谱中的吸收波数相一致，所以谱图的解析也与红外吸收光 谱相同。然而，通常在拉曼光谱中出现的强谱带在红外光谱中却成为弱谱带甚至 不出现，反之亦然。所以，这两种光谱技术常互为补充。
拉曼光谱的优点在于它的快速，准确，测量时通常不破坏样品（固体，半固 体，液体或气体），样品制备简单甚至不需样品制备。谱带信号通常处在可见或 近红外光范围，可以有效地和光纤联用。这也意味着谱带信号可以从包封在任何 对激光透明的介质，如玻璃，塑料内，或将样品溶于水中获得。现代拉曼光谱仪 使用简单，分析速度快（几秒到几分钟），性能可靠。因此，拉曼光谱与其他分 析技术联用比其他光谱联用技术从某种意义上说更加简便（可以使用单变量和多 变量方法以及校准）。
除常规的拉曼光谱外，还有一些较为特殊的拉曼技术。它们是共振拉曼，表 面增强拉曼光谱， 拉曼旋光，相关-反斯托克拉曼光谱，拉曼增益或减失光谱以 及超拉曼光谱等。其中，在药物分析应用相对较多的是共振拉曼和表面增强拉曼 光谱法。
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⑴ 共振拉曼光谱法
当激光频率接近或等于分子的电子跃迁频率时，可引起强列的吸收或共振， 导致分子的某些拉曼谱带强度急剧增强数百万倍，这就是共振拉曼效应。
许多药物在紫外-可见光区有强的电子跃迁。某些含发色团化合物的拉曼光 谱因共振而增强，而其基体物质的光谱却不会增强。共振拉曼技术与常规拉曼光 谱技术不同之处在于要求光源可变，可调谐染料激光器是获得共振拉曼光谱的必 要条件。
有些化合物可通过化学反应改变其结构，使之最大吸收峰接近激发光频率， 如生成有色化合物，然后再进行共振拉曼光谱测定也是一个提高灵敏度的较有效 的方法。
共振拉曼技术由于灵敏度高而特别适用于药物和生物大分子的研究。但伴随 样品本身或由杂质引起的荧光，以及为这一特殊光谱所需的激光和光学设计费 用，限制了共振拉曼光谱的应用。
⑵ 表面增强拉曼光谱法（SERS） 吸附在极微小金属颗粒表面或其附近的化合物（或离子）的拉曼散射要比该
化合物的正常拉曼散射增加 103～106 倍。这种表面增强拉曼散射(SERS)在银表 面上最强，在金或铜的表面上也可观察到。
SERS 现象主要由金属表面基质受激而使局部电磁场增强所引起。效应的强 弱取决于与光波长相对应的表面粗糙度大小，以及和波长相关的复杂的金属电介 质作用的程度。许多 SERS 基质可以用于药物分析，最常用的包括溶胶，电极， 电介质表面金属膜等。
带孤对电子或 π 电子云的分子呈现的 SERS 效应最强，其他芳氮或含氧化合 物，如芳胺和酚，也具有强的 SERS 活性，这一效应在其他电负性功能团如羧酸 中也能观察到。
从少数分子获得大量结构信息的可能性使得 SERS 可用于解决高灵敏度化 学分析的许多问题。在表面增强拉曼光谱中，荧光的干扰可有效地得到抑制。
定性和含量测定
1、定性鉴别 拉曼光谱可提供有关样品分子中存在何种功能团的结构信息。所以可用于鉴
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别试验和结构解析。 在相同的测定条件下，绘制供试品与对照品的拉曼光谱进 行比对，若两光谱相同，即鉴别为同一化合物。如遇多晶现象，可参照红外鉴别 的相关内容进行处理。
2、含量测定 拉曼谱带的强度与待测物浓度的关系遵守比尔定律：
I V = KLCI 0
其中 I V 是给定波长处的峰强，K 代表仪器和样品的参数，L 是光路长度，C 是样 品中特定组分的摩尔浓度，I 0 是激光强度。实际工作中，光路长度被更准确的描 述为样品体积，这是一种描述激光聚焦和采集光学的仪器变量。上述等式是拉曼 定量应用的基础。
3、影响定量测定的因素 最主要的干扰因素是荧光、样品的热效应和基质或样品自身的吸收。在拉曼
光谱中，荧光干扰表现为一个典型的倾斜宽背景。因此，荧光对定量的影响主要 为基线的偏离和信噪比下降，荧光的波长和强度取决于荧光物质的种类和浓度。 与拉曼散射相比，荧光通常是一种量子效率更高的过程，甚至很少量不纯物质的 荧光也可以导致显著的拉曼信号降低。使用更长的波长例如 785nm 或 1064nm 的 激发光可使荧光显著减弱。然而，拉曼信号的强度与λ
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成比例，λ是激发波长。
通过平衡荧光干扰、信号强度和检测器响应可获得最佳信噪比。
测量前将样品用激光照射一定时间，固态物质的荧光也可得以减弱。这个过 程被称为光致漂白，是通过降解高吸收物质来实现的。光致漂白作用在液体中并 不明显，可能是由于液体样品流动性，或荧光物质不是痕量。
样品加热会造成一系列的问题，例如物理状态的改变（熔化），晶型的转变 或样品的烧灼。这是有色的、具强吸收或低热传导的小颗粒物质常出现的问题。 样品加热的影响通常是可观察的，表现在一定时间内拉曼光谱或样品的表观变 化。除了减少激光通量，有许多种方法可用来降低热效应，例如在测量过程中移 动样品或激光，或者通过热接触或液体浸入来改善样品的热传导。
基质或样品本身也可吸收拉曼信号。在长波傅里叶变换拉曼系统中，拉曼信 号可以与近红外的泛频吸收重叠。这种影响与系统的光学以及样品的形态有关。 装填和颗粒大小的差异而引起的固体散射的可变性与这种效应有关。然而，由于
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在拉曼光谱中样品的有限穿透深度和相对狭窄的波长范围，所有这些效应的大小 都没有近红外光谱严重。 定量拉曼光谱与许多其它的光谱技术不同，它是单光
束零背景测量。谨慎地
进行样品测定以及使用设计合理的仪器可以使这种变异减到最小，但是并不能全 部消除。所以，绝对的拉曼信号强度很难直接用于待测物的定量。变异的潜在来 源是样品的不透明性和样品的不均匀性、照射样品的激光功率的变化以及光学几 何学或样品位置的变化。这些影响可以通过能重复的或有代表性的样品处置方式 予以减小。
由于拉曼信号绝对强度的波动，使用内标是最普通和有效的减少可变性的方 法。内标方法有几种变通选择。可以有目的地加入一种内标，该内标应具有与待 测物互不干扰的独特谱带以便检测。在溶液中，也可利用溶剂的独特谱带，因为 溶剂随样品不同将相对保持不变。另外，在制剂中，如果赋形剂量大大超过待测 组分，则可以使用该赋形剂的峰。在假设激光和样品定位的改变将会同等地影响 全光谱的前提下，全光谱同样可以用作参比。
样品测定中需考虑的重要因素还有光谱的污染。拉曼是一种可以被许多外源 影响掩蔽的弱效应。普通的污染源包括样品支持物（容器或基质）和周围光线。 通常，这些问题可以通过细致的实验方法来识别和解决。
仪器装置
根据获得光谱的方式，拉曼光谱仪可分为 FT 拉曼光谱仪和色散型拉曼光谱 仪，但所有的现代拉曼光谱仪均包括激光光源、样品装置、滤光器、单色器（或 干涉仪）和检测器等组成。
⑴激光光源
表 1 列出几种在药学应用中经常使用的激光。紫外激光有时也有特殊应用， 但是由于种种原因在常规分析中很少采用。
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表 1：药学应用中的主要激光
激光波长 λ ，纳 类型 米（近似整数） 近红外激光 1064 激光典 波长范围（纳米）斯托（100cm –1～3000 注释 型功率 克区域cm –1） 固态（钕：YAG） 最大 3W 1075–1563 常在傅里叶 变换仪器中 使用 在多数色散 拉曼中广泛 存在 785 二极管 最 大 791–1027 500MW 紫外-可见光 488–632.8 紫外-可见
荧光风险 荧光风险 离子气和固态， 最大 1W 488–781 双频率激光 染料激光器 可调 在紫外和可见光区可调 ⑵ 样品装置
可有各种各样的样品放置方式，包括直接的光学界面，显微镜，光纤维探针 （不接触或光学浸入）和样品室（包括特殊的样品盛器和自动样品转换器）。样 品光路也可被设计成能获得偏振相关拉曼光谱，这种光谱通常包含附加信息。样 品装置的选择应根据待测物的具体情况（如样品的状态、体积等）以及测量的速 度，激光的安全性和样品图谱的质量要求等决定。
⑶ 滤光装置 激光波长的散射光（瑞利光）要比拉曼信号强几个数量级，必须在进入检测
器前滤除。陷波滤波器几乎被普遍应用于这个目的，它具有滤波效果好和体积小 等优点。另外，为防止样品不被外辐射源（例如：房间的灯光，激光等离子体） 照射，需要设置适宜的滤波器或者物理屏障。
⑷ 光波处理装置 光波信号可通过色散或者干涉（傅里叶变换）来处理。任何合格仪器都适用
于定性鉴别。然而，选择定量测定用仪器时，应注意色散和线性响应可能在整个 波谱范围内并不均衡（例如当使用阶梯光栅分光镜时）。
⑸ 检测器
硅质 CCD 是色散仪器中最常用的检测器。这种冷却的阵列检测器允许在低 噪声下的快速全光谱扫描。常与通常使用的 785 纳米二极管激光器配合使用。傅 里叶变换仪器通常采用单通道锗或铟－镓－砷化合物(InGaAs)检测器以配合钕：
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