V-滴定消耗氢氧化钠标准溶液毫升数。 Ⅳ、18%中性甲醛
取36~40%甲醛加1倍蒸馏水稀释，加酚酞指示剂2~3滴，用0.1 N氢氧化钠中和至微红色。
(3)测定方法
准确吸取发酵离心上清液10-25 mL于250 mL三角瓶中，加蒸馏水50 mL，甲基红指示剂2滴，用0.1 N盐酸调至红色，再用0. 05 N氢氧化钠调至橙黄色，加18%中性甲醛4 mL，摇匀放置10 min，加酚酞指示剂8滴，用0.05 N氢氧化钠标准溶液滴定至微红色。
计算：氨基氮（mg/100 mL）=N*V×0. 014×100 ×1000/5 3.2.3 菌浓测定：离心体积和干重
用50ml尖底离心管，用分析天平先精确称其重量，取50ml发酵液4000rpm离心10min，将上清倒出至另一离心管中备用测其他参数，大概读取菌体沉淀体积，得到离心体积百分比。将沉淀用去离子水洗涤一次再次在相同条件下离心，弃上清，于80摄氏度烘箱中烘干至恒重，利用差重法得到发酵液DCW。 3.2.4 葡萄糖酸钠含量的测定
葡萄糖酸钠含量通过HPLC法测定。测定条件为，色谱分离柱：C18柱(4.6mm×250mm，5μm) ；流动相：水:甲醇:1%磷酸溶液150mL:10%四丁基氢氧化铵=324:25:150:1；检测波长：210nm；流速：1mL/min；柱温：26℃；进样量：20μL。
4实验结果与讨论 4.1 葡萄糖含量
图 1 葡萄糖含量曲线
由图1可以看出，发酵前期孢子处于活化萌发期，属于延滞期。8h后葡萄糖的含量直线下降，21h左右时降为0，这主要是由于黑曲霉菌是以葡萄糖作为碳源的，主要用于菌体的生长和维持；另外葡萄糖酸的合成前体也是葡萄糖。因此，在发酵过程中葡萄糖不断地被利用，直至消耗完。由发酵综合曲线可知，在22h时开始流加碳源，因此曲线上显示葡萄糖的含量有所上升，但又被短时间内耗竭。
4.2 总糖和还原糖含量
图 2 总糖含量曲线
图 3 还原糖含量曲线
由图2和图3可知，总糖和还原糖含量与葡萄糖含量曲线基本保持一致。这是由于本次发酵只用了一种糖即葡萄糖。可能发酵过程中，三种参数会有微小的差异。 4.3 氨基氮
图 4 发酵液中氨基氮含量的测定
由图4可知，发酵前期菌处于延滞期，含量变化不大，8h后菌体开始生长，耗氮比较多，到16h黑曲霉菌开始合成产物葡萄糖酸，后期有微幅增长，可能是测量误差引起。
4.4 葡萄糖酸钠
表4.1 HPLC测定葡萄糖酸钠含量
时间(h)
峰面积
出峰时间(min)
8 16 20 32 40 标准葡萄糖酸
- 175.946 209.938 125.527 121.743 452.344
- 2.813 2.809 2.812 2.811 2.813
葡萄糖酸含量(g/L)
- 62.234 148.516 177.602 215.310 1.600
图 5 葡萄糖酸含量的测定
由图5可知，到8h后菌体开始产酸及葡萄糖酸，通过流加碱达到控制PH恒定，同时产物发生中和反应生成葡萄糖酸钠。放灌时，产物仍在积累，说明菌体还处于稳定期，可以稍微延长发酵时间，以便得到更多的产品。
4.5 菌体浓度的测定
图 6 菌体浓度的测定
由图6可知，第一次测定可能有误，菌体一直处于增长状态，这其实不利于获得更多的产品。或许可以调整发酵条件来使后期的菌体生长放缓 4.6 菌体生长情况
在0~32 h内每隔8 h取样，对菌体进行拍照，菌体生长情况如下图所示，由图可知，在0~8 h内在显微镜下无法观察到菌体，在16 h以后可以观察到较明显的菌丝。