作者】周卉芬； 【导师】王伟；
【作者基本信息】汕头大学，心血管内科学， 2010，硕士
【摘要】目的:1.研究SIRTs(SIRT1-7)在大鼠心脏组织及H9c2心肌细胞的定位;2.初步探讨热量限制对心肌细胞SIRT1-7表达的影响。方法:3个月龄健康雄雌SD大鼠20只,随机分成两组:①正常对照组(ad libitum,AL)(n=10):随意进食;②热量限制组(Calorie Restriction,CR)(n=10):喂养量为对照组的60%,分别称体重。饲养3周后称体重,用质量分数2 %的戊巴比妥麻醉后处死,取出心脏,称重,沿心脏纵轴平均分为三份,心尖及心底部用于Western blot,对比两组SIRT1-7蛋白表达水平的变化;中间部分心脏用于免疫组织化学,定性检测SIRT1-7在大鼠心脏组织的定位。大鼠心肌细胞株H9c2在含葡萄糖4.5g/L的DMEM培养基中培养48h后传代随机分为两组:①正常对照组(Control,Con):继续在含葡萄糖4.5g/L的DMEM中培养;②热量限制组(CR):弃去旧培养液,加入含葡萄糖1g/L的DMEM。两组细胞在5% CO2、37℃条件下继续培养24h后终止。免疫细胞化学法定性检测SIRT1-7在H9c2的定位; RT-PCR法检测SIRT1-7 mRNA表达水平的变化。结果:1.实验前两组大鼠两两体重的差别无统计学意义。心脏质量指数(HMI)=心脏重量/大鼠体重。实验后CR组大鼠体重及HMI均显著低于AL组(p<0.05)。2.免疫组织化学法检测SIRT1-7在大鼠心肌细胞定位,结果表明:SIRT1在细胞核及细胞质均有大量表达,以细胞核表达为主;SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5主要在细胞质表达;SIRT6、SIRT7在细胞核及细胞质均有表达,主要在细胞核表达。3.免疫细胞化学法检测SIRT1-7在H9c2细胞表达定位,结果表明:SIRT1、SIRT2、SIRT7在细胞核及细胞质均有表达,以细胞核表达为主;SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6在细胞质表达为主。4. Western Blot法检测热量限制对大鼠心肌细胞SIRT1-7蛋白表达水平的影响,结果表明:CR组SIRT1,2,3,4,7蛋白表达水平与AL组比较显著增加(p<0.05);SIRT5,6的蛋白表达在两组中没有差异。5. RT-PCR法检测热量限制对H9c2细胞SIRT1-7 mRNA表达水平的影响,结果表明:其变化与大鼠心脏SIRT1-7蛋白表达水平的变化一致。SIRT1,2,3,4,7 mRNA表达水平与正常对照组比较明显增加(p<0.05),SIRT5,6 mRNA的表达在两组中没有差异。结论:1.在心肌细胞中,SIRT1在细胞核及细胞质均有大量表达,以细胞核表达为主;SIRT2,3,4,5主要在细胞质表达;SIRT6、SIRT7主要在细胞核表达。2.热量限制可同时激活心肌细胞SIRT1,2,3,4,7,而对SIRT5,6的表达没有影响;初步推测热量限制对心肌细胞的作用可能与SIRT1,2,3,4,7表达的上调有关。 更多还原 【关键词】热量限制；SIRTs；心肌细胞； 【文内图片】
四组大鼠实验后HMI：
免疫组织化学法检测SIRTs在大鼠心肌细胞的表达情况（颗粒呈棕褐色为阳性，×1000）
免疫组织化学法检测SIRTs在H9c2心肌细胞的表达情况（颗粒呈棕褐色为阳性，×1000）
AWesternBlot法检测SIRT1-7蛋白的表达
Figure-3ATheproteinexpressionofSIRT1-7inhearttissuesofratsbyWesternBlotanalysis
BSIRT1-7蛋白表达灰度值分别与β-actin比值的变化
ART-PCR法检测SIRT1-7mRNA表达的凝胶电泳成像
BSIRT1-7mRNA灰度值分别与18SrRNA比值的变化
? 【网络出版投稿人】汕头大学
中文摘要
目的：
1. 研究 SIRTs（SIRT1-7）在大鼠心脏组织及 H9c2 心肌细胞的定位； 2. 初步探讨热量限制对心肌细胞 SIRT1-7 表达的影响。
方法：
3个月龄健康雄雌SD大鼠20只，随机分成两组：①正常对照组（ad libitum，AL）（n=10）： 随意进食；②热量限制组（Calorie Restriction，CR）（n=10）：喂养量为对照组的60%，分 别称体重。饲养3周后称体重，用质量分数2 %的戊巴比妥麻醉后处死，取出心脏，称重， 沿心脏纵轴平均分为三份，心尖及心底部用于Western blot，对比两组 SIRT1-7蛋白表达水 平的变化；中间部分心脏用于免疫组织化学，定性检测 SIRT1-7 在大鼠心脏组织的定位。 大鼠心肌细胞株H9c2 在含葡萄糖4.5g/L的DMEM培养基中培养48h后传代随机分为 两组：①正常对照组（Control，Con）：继续在含葡萄糖 4.5g/L 的 DMEM 中培养；②热量 限制组（CR）：弃去旧培养液，加入含葡萄糖 1g/L 的 DMEM。两组细胞在 5% CO
2
、37
℃条件下继续培养 24h 后终止。免疫细胞化学法定性检测 SIRT1-7 在 H9c2 的定位； RT-PCR 法检测 SIRT1-7 mRNA 表达水平的变化。
结果：
1. 实验前两组大鼠两两体重的差别无统计学意义。心脏质量指数（HMI）=心脏重量/ 大鼠体重。实验后 CR 组大鼠体重及 HMI 均显著低于 AL 组（p<0.05）。
2. 免疫组织化学法检测 SIRT1-7 在大鼠心肌细胞定位，结果表明：SIRT1 在细胞核及 细胞质均有大量表达，以细胞核表达为主；SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5 主要在细胞质 表达；SIRT6、SIRT7 在细胞核及细胞质均有表达，主要在细胞核表达。
3. 免疫细胞化学法检测 SIRT1-7 在 H9c2 细胞表达定位，结果表明：SIRT1、SIRT2、 SIRT7 在细胞核及细胞质均有表达，以细胞核表达为主；SIRT3、 SIRT4、 SIRT5、SIRT6汕头大学医学院硕士学位论文 在细胞质表达为主。
4. Western Blot 法检测热量限制对大鼠心肌细胞 SIRT1-7 蛋白表达水平的影响，结果表 明：CR 组 SIRT1，2，3，4，7 蛋白表达水平与 AL 组比较显著增加（p<0.05）；SIRT5，6 的蛋白表达在两组中没有差异。
5. RT-PCR 法检测热量限制对 H9c2 细胞 SIRT1-7 mRNA 表达水平的影响，结果表明： 其变化与大鼠心脏 SIRT1-7 蛋白表达水平的变化一致。SIRT1，2，3，4，7 mRNA 表达水 平与正常对照组比较明显增加（p<0.05），SIRT5，6 mRNA 的表达在两组中没有差异。
结论：
1. 在心肌细胞中，SIRT1 在细胞核及细胞质均有大量表达，以细胞核表达为主；SIRT2， 3，4，5 主要在细胞质表达；SIRT6、SIRT7 主要在细胞核表达。
2. 热量限制可同时激活心肌细胞 SIRT1，2，3，4，7，而对 SIRT5，6 的表达没有影响； 初步推测热量限制对心肌细胞的作用可能与 SIRT1，2，3，4，7 表达的上调有关。
关键词热量限制；SIRTs；心肌细胞 - 1 -
第1章前言
中国正迈入老龄化社会。伴随着老龄人口的增加，心血管疾病对人类的威胁将持续增 加。近年来，随着居民生活水平的不断提高，饮食习惯的改变和自然环境的不断恶化，我 国心血管疾病的发病率和死亡率都呈逐年上升的趋势。随着人口老龄化，心力衰竭在增多， 严重危害人类健康。因此，如何对抗衰老和延缓年龄相关性疾病，尤其是对如何减少心血 管疾病的发病率和死亡率，引起了科学家们广泛的关注，也有着非常重要的现实意义。 在延缓衰老的众多实验研究中，热量限制是唯一经过广泛的科学实验验证，除遗传操
作以外最强有力的延缓衰老和年龄相关性疾病的方法。1935年，美国科学家McCay等人首 次发现，通过限制食物的摄入，可使啮齿类动物的寿命延长 【1】
。此现象激发了人们的研究
热情，限制食物摄入这种实验方法被许多科学研究者应用到包括从酵母到灵长类动物等各 种物种中 【2，3】
。典型的热量限制（Calorie Restriction，CR）膳食是指满足机体对蛋白质、
维生素和矿物质等必需营养素的同时，通过减少糖类或脂肪的摄入，使得食物提供的总能 量为随意饮食（ad libitum，AL）的60%-70% 【4】
。CR的啮齿类动物不仅出现了寿命的延长，
还有体温、血糖、胰岛素水平、胰高血糖素水平、脂肪和体重的下降，伴随着胰岛素敏感 性、器官体积（除脑外）的增加 【4】
。而人类通过CR饮食也可使血糖、血压、胆固醇水平都 有改善 【5，6】
。Weindruch等人通过DNA微矩阵技术证明了CR可以延缓小鼠骨骼肌和脑组织 中衰老引起的基因改变 【7】
。最近的大量研究也发现，CR可以减少啮齿类动物及哺乳类动 物的年龄相关性疾病如肿瘤、心血管疾病的发生率 【8】 。
在过去的数十年中，许多的实验都证明了沉寂信息调节因子2（Silence information
regulator 2，Sir2 ) 家族在CR的低级动物，如酵母、果蝇及线虫的衰老过程都扮演了非常重
要的角色。Lin等人通过改变酵母培养基中糖的浓度（从正常的2%降到0.5%）制作一个CR 的模型，母酵母分裂次数增加了30%-40%，并且证明了CR的延寿作用是通过增加酵母的呼 吸而激活Sir2 【9】
。进一步的研究观察到了CR酵母的NADH水平下降 【10】 。NAD +
/NADH比值
的增加对Sir2的激活起作用 【10】
，并不是由于NAD +
的增加，而是由于NADH的减少 【2，9，10】 ，
NADH是Sir2的竞争性抑制剂，NADH的减少可上调Sir2的表达。Anderson等人的实验结果 则从另一方面证明了CR与Sir2的关系。烟酰胺酶I基因（pyrazinamidase/nicotinamidase 1， PNC1）编码的酶可使Sir2的抑制剂烟碱（NAM）脱氨基，而CR可使PNC1增加，NAM减 少，也是酵母CR的延寿作用所必须的