分子生物学常用缓冲液、试剂和贮存液的配制
1、 6*Loading Buffer(DNA电泳用,50ml配方)
组分浓度:100mM EDTA, 40%(V/V) 蔗糖, 0.05%(W/V)xylene cyanol FF, 0.05%(W/V)溴酚蓝 配制方法:称取25mg溴酚蓝,25mg xylene cyanol FF,5ml 0.5MEDTA,加入约20ml去离子水,加热搅拌,充分溶解,加入20g蔗糖,去离子水定容至50ml。
2、10*PBS(pH7.2~7.4,分子克隆推荐配方)
组分浓度: NaCl 137 mmol/L,
KCl 27 mmol/L, Na2HPO4 100 mmol/L, KH2PO4 20 mmol/L
配置方法:用800ml去离子水溶解80 g NaCl, 2 g KCl,14.4 g Na2HPO4和2.4 g KH2PO4。用盐酸调节pH至7.4,加水定容至1 L,高温高压灭菌,室温保存。
3、20*SSC (pH约7.0)
组分浓度:300 mmol/L 柠檬酸三钠,3 mol/L 氯化钠
配制方法:称取柠檬酸三钠·2H2O 88.23 g,氯化钠175.3 g,加入800 ml去离子水充分溶解,用14 N HCl调pH为7.0,去离子水定容至1 L,高温高压灭菌后室温保存。 4、10*Tris-甘氨酸 转膜液(pH约8.3) 1 L 组分浓度:0.25 M Tris,1.92 M 甘氨酸
配制方法:甘氨酸144.13 g,Tris 30.29 g,去离子水溶解定容至1 L。 使用前,100 ml 10*转膜液,加入200 ml甲醇,700 ml去离子水成为1*转膜液 5、10*Tris-甘氨酸-SDS 电泳缓冲液(SDS-PAGE电泳缓冲液,pH约8.6) 组分浓度:0.25 M Tris,1.92 M 甘氨酸,1%(W/V)SDS
配制方法:称取30.29 g Tris,,144.13 g甘氨酸,5 g SDS,加入800 ml去离子水搅拌溶解,定容至1 L,常温保存。 6、10*TBS
组分浓度:200 mM Tris(pH约为7.4),9% NaCl,HCl调pH至7.4
配制方法:800 ml去离子水溶解24.23 g Tris,90 g氯化钠,盐酸调pH至7.4,定容至1 L,高温高压灭菌,常温保存。
7、100*Tris EDTA Buffer (100*TE,pH 7.4,7.6, 8.0)
组分浓度: 1 M Tris-cl,100 mM EDTA(pH8.0)
配制方法: 称取121.1 g Tris,用500 ml去离子水充分溶解,加入200 ml 0.5 M EDTA(pH 8.0),盐酸调节至所需pH,加水定容至1 L,高温高压灭菌,室温保存。 8、10*TAE
组分浓度:0.4 M Tris 乙酸盐,pH 约为 8.3,含有 0.01 M EDTA。用 18 兆欧水制备的溶液 .
采用经生物技术性能认证的 Trizma 碱 (T6066) 和分子生物学试剂 EDTA (E5134) 制备。溶液还含有乙酸 (A6283);粉末状混合物含有 Trizma 醋酸盐 (T1258)。 配制方法:
(43)20*SSPE
组分浓度:3 M氯化钠,0.2 M NaH2PO4,0.02 M EDTA
配制方法:在800 ml水中溶解175.3 g NaCl、27.6 g NaH2PO4?H2O和7.4 g EDTA,用NaOH调节pH值至7.4,(约需6.5 ml 10 ml/L NaOH),加去离子水定容至1 L,分装后高压灭菌,室温保存。
(19) 常用核酸电泳缓冲液
缓冲液 50*TAE (pH 8.5) 组分浓度 2 M Tris-醋酸 0.1 M EDTA 1L配制方法 备注 称取242 g Tris, 37.2 g Na2EDTA·2H2O,加入约800 ml去离子水充分搅拌溶解,加入57.1 ml的醋酸,充分搅拌,定容至1 L,室温保存。 10*TBE (pH8.3) 890 mM Tris-硼酸 20 mM EDTA BE 溶液长时间存放后会形成称取108 g Tris, 7.44 g 沉淀物,出现沉淀后则予Na2EDTA·2H2O,硼酸55 以废弃。一般都以 1×TBE 作为使用液进行琼脂糖凝g,加入约800 ml去离子胶电泳。但 0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。 水充分搅拌溶解,定容至进行聚丙烯酰胺凝胶垂直1 L,室温保存。 槽的缓冲液槽较小,故通过缓冲液的电流量通常较大,需要使用 1×TBE 以提供足够的缓冲容量。 10*MOPS 200 mM MOPS 20 mM醋酸钠 10 mM EDTA 称取41.8 g MOPS,加入约700 ml DEPC处理水充分搅拌溶解,用2 N NaOH调节pH至7.0,再加入20 ml DEPC处理的1M醋酸钠,20 ml DEPC处理的0.5 M EDTA, DEPC水定容至1 L。用0.45 μm滤膜过滤除去杂质,室温避光保存。 溶液见光或高温灭菌后会变黄,变黄时可使用,但变黑时坚决不能使用。 (22) 10*Loading Buffer(RNA电泳用,10ml配方)
组分浓度:10 mM EDTA, 50% (V/V) Glycerol, 0.25% (W/V)xylene cyanol FF, 0.25% (W/V)溴酚蓝 配制方法:称取25 mg溴酚蓝,25 mg xylene cyanol FF,加入200 μl 0.5 M EDTA (pH 8.0),加入约4 ml DEPC处理水,充分搅拌溶解,加入5 ml甘油,DEPC去离子水定容至10 ml,室温保存。
(50) 凝胶加样缓冲液
缓冲液类型
6×缓冲液
0.25%溴酚蓝
贮存温度
Ⅰ
0.25%二甲苯青 FF 40%(W/V)蔗糖水溶液
4℃
0.25 溴酚蓝
Ⅱ
0.25%二甲苯青 FF 15%聚蔗糖(Ficoll400)
室温
0.25%溴酚蓝
Ⅲ
0.25%二甲苯青 FF 30%甘油水溶液
4℃
0.25%溴酚蓝
Ⅳ
40%(W/V)蔗糖水溶液 碱性加样缓冲液: 300mmol/L NaOH 6mmol/L EDTA
4℃
18%聚蔗糖(Ficoll400)
Ⅴ
0.15%溴甲酚绿 0.25%二甲苯青 FF
4℃
使用凝胶加样缓冲液的目的有三:增大样品密度;以确保 DNA 均匀进入样品孔内;使样品呈现颜色,从而使 加样操作更为便利,含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲 苯青 FF 的 2.2 倍,而与琼脂糖浓度无关。
以 0.5×TBF 作电泳液时,溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长 300bp 的双链线状 DNA 相同,而二甲苯青 FF 的泳动则与长 4kb 的双链线状 DNA 相同。在琼脂糖浓度为 0.5%~1.4%的范围内,这些对应关系受凝 胶浓度变化的影响并不显著。
选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是,对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料,因为在碱性 pH条 件下其显色较溴酚更蓝为鲜明。
(52)LB培养基
组分浓度:1% (W/V) Tryptone,0.5% (W/V) Yeast Extract,1% (W/V) NaCl
配制方法:称取10 g Tryptone,5 g Yeast Extract,10 g NaCl,加入800 ml去离子水充分溶解,滴加5 N
NaOH (约0.2ml),调节pH至7.0,定容至1 L,高温高压灭菌后4 ℃保存。