Brucella abortus induces apoptosis of human T lymphocytes
流产布鲁氏菌诱导人类T淋巴细胞的凋亡
摘要：免疫逃避是布鲁氏菌在面对CD4+T细胞有效的适应性反应后在其内存活的必
要条件。之前我们已经证明B.abortus可以通过下调MHC-Ⅱ分子的表达及巨噬细胞的抗原呈递间接的抑制CD4 + T细胞。然而，目前还不清楚B.abortus是否能够直接干扰T淋巴细胞。据报道，即使低水平的和非复制型的入侵T淋巴细胞，B.abortus也能诱导人类T淋巴细胞的凋亡。灭活的B.abortus也能产生同样的现象，说明有一个复杂的细菌的结构成分。我们已证明，典型的B.abortus外膜脂蛋白（L-Omp19），而并非他的非脂化形式，能诱导人类T淋巴细胞的凋亡。此外，合成的脂己肽能模拟蛋白的脂质部分的结构也能诱导T淋巴细胞死亡的增加，这表明牵连到现象的结构部件可以是任何B.abortus脂蛋白。B.abortus诱导的T淋巴细胞的凋亡依赖于TNF-α的分泌，因为用抗TNF-α的单克隆抗体预孵育的T淋巴细胞细胞的凋亡被抑制。总体而言，这些结果说明了一种新机制，通过直接抑制T细胞介导的反应B. abortus可能逃避适应性免疫反应。
1.前言
布鲁氏菌的感染已被证明能强而有效的激活先天的免疫系统，能导致一个前炎症反应，有利于T淋巴细胞分化Th1。此反应是消除感染的关键。然而，布鲁氏菌可以在巨噬细胞存活很多年，逃避宿主细胞介导的免疫反应并建立慢性感染。T细胞免疫应答的产生需要抗原呈递细胞（APCs）的提呈和MHC 的基因表达。 MHC 分子在免疫应答中具有重要的生物学意义：一方面，MHC 分子直接参与抗原提呈细胞(APC) 对内源性或外源性抗原的提呈；另一方面，TCR (T细胞表面特异性识别受体) 在特异性识别 APC 所提呈的抗原肽过程中，必须同时识别与抗原肽结合成复合物的 MHC 分子，才能产生 T 细胞激活信号，即 MHC 限制性。因此，为了逃避T淋巴细胞的应答反应，建立慢性感染，布鲁氏菌可能采用不同的方法。这种策略可以间接靶向APCs（例如：抗原呈递受损），直接靶向T淋巴细胞，或者两者都可以。
关于流产布鲁氏菌是如何在巨噬细胞生存的，已经了解的很多。然而，流产布鲁氏菌是以何种方式干扰适应性T细胞免疫还不完全了解。我们目前的研究已经证明，流产布鲁氏菌感染人类单核细胞或巨噬细胞能抑制MHC-II分子的表达和CD4+T淋巴细胞抗原的呈递。这种现象是由布鲁氏菌脂蛋白引起的，依赖于Toll样受体2（TLR2），并受到白细胞介素-6（IL-6）调节。同时，流产布鲁氏菌的脂多糖（LPS）通过在APCs的细胞膜上形成LPS的微结构域破坏MHC-II的递呈途径。布鲁氏菌在巨噬细胞内长时间的生存和繁殖的机制说明，布鲁氏菌能间接调节CD4 + T细胞的功能。
目前还不清楚流产布鲁氏菌是否能够直接干扰T淋巴细胞。本实验室以前的研究结果已经证明，流产布鲁氏菌感染个体在疾病的慢性期Th1反应发生减弱。此外，还指出慢性布鲁氏菌病患者外周血CD4+、CD8+淋巴细胞呈现出一个减少的时期。这些结果表明，流产布鲁氏菌可以通过减少在慢性感染的T淋巴细胞的数量限制T淋巴细胞反应。
近来病原体诱导T淋巴细胞凋亡受到很大的关注，因为它是一个重要的免疫系统的调节机制，并涉及了感染性疾病在发展过程中效应功能的损失。某些微生物的病原体可能会提高他们在受感染的宿主内生存能力，使宿主细胞在防御过程中致使细胞死亡，其中T淋巴细胞是一个主要的靶细胞。因此，T淋巴细胞的凋亡在布鲁氏菌的感染和生存的过程中发挥着重要的作用。尽管布鲁氏菌主要存在于巨噬细胞内，在细胞外的感染和传播过程中也存在。因此，这些微生物会在他们的生活周期中直接与T淋巴细胞相互作用。
在这项研究中，我们研究流产布鲁氏菌是否能直接影响T淋巴细胞的生存。此外，我们还研究了流产布鲁氏菌的组成部分及其在这种现象中的相关作用机制。
2材料与方法
2.1 细菌的培养
流产布鲁氏菌S2308细胞在10ml的胰蛋白酶大豆汤中37℃摇床培养过夜。4℃ 6000转离心15min收菌，用10ml PBS洗两次。与实验室在600nm处的光密度的标准曲线相比较计算细菌的数量。将培养物用PBS稀释到所需的浓度，通过在胰酶大豆琼脂糖培养基上涂板来测定接种物的浓度。为了获得灭活的流产布鲁氏菌，用无菌的PBS洗涤5次，每次10min，70度热灭活20min，分装，-70°C保存备用。灭活后的流产布鲁氏菌涂板验证，没有细菌生长。所有活的布鲁氏菌要在P3安全实验室进行。
2.2克隆，表达和纯化重组L-Omp19和U-OMP19
如先前所述，克隆和纯化脂蛋白，为了消除LPS造成的污染，用琼脂糖多粘菌素B吸附重组的外膜蛋白。用Limulus Amebocyte Lysate鲎试剂是由海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品，含有能被微量细菌内毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，凝固蛋白原，能够准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素和（1,3）-β-葡聚糖激。目前，鲎试剂广泛用于制药、临床以及科研等领域，用于细菌内毒素和真菌葡聚糖检测。目前使用的鲎试剂分为美洲鲎试剂和东方鲎试剂两大类。 实验检测，这两种蛋白所含内毒素均小于0.25U/ug。BCA法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。测定蛋白浓度，用牛血清白蛋白为标准。将纯化的蛋白分装，-70°C保存备用。
2.3 LPS和脂肽
流产布鲁氏菌s2308 LPS由I.Moriyon提供（纳瓦拉大学，潘普洛纳，西班牙）。该制剂的纯度和特性在其他地方已经描述了。人工合成的脂己肽购自Boehringer Mannheim德国宝灵曼公司。
2.4细胞和培养基
所有的实验均在RPMI1640培养基37度5%的CO2。采集健康人的血液通过聚蔗糖-泛影葡胺（GE医疗）梯度离心分离外周血单核细胞（PBMCS）。T淋巴细胞从外周血单核细胞分离得到，使用CD3+ CD4+和CD8+T淋巴细胞负分离试剂盒，按照操作说明进行分离。通过流式细胞仪验证分离纯化的CD3+ CD4+和CD8+T的浓度分别大于98%，90%和78%。THP-1细胞从美国典型培养物保藏中心获得的，并如前面所述培养。通过台酚蓝排斥实验测定，细胞的存活率为95%以上。
2.5体外感染
用流产布鲁氏菌以不同方法多重感染THP-1细胞或T细胞并在不含抗生素的培养基上培养2h。然后将细胞充分的洗涤以除去外面的细菌，感染的细胞应在含100微克/毫升庆大霉素和50微克/毫升链霉素的条件下培养以便杀死残留的胞外菌。在不同的时间感染后，在处理之前用PBS将细胞洗涤3次。为了检测布鲁氏菌在细胞内的生存，用0.1%的Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)裂解感染的细胞，然后用PBS洗涤稀释后在蛋白胨大豆琼脂糖培养基上培养CFU计数。
2.6细胞凋亡检测
用布鲁氏菌以不同的MOI :multiplicity of infection，感染复数。传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为PFU（plaque forming unit，空斑形成单位）。一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是PFU number/cell。后来MOI被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值感染T淋巴细胞或者用HKBA, L-Omp19,U-Omp19, Pam3Cys刺激并在特定的浓度下培养24h，48h或者6天。然后，洗涤细胞并用膜联蛋白V-FITC（BD Biosciences公司）和碘化丙啶（PI;BD Biosciences公司在冰上避光孵育10分钟。通过FACSCalibur流式细胞仪检测细胞凋亡率和使用FlowJo软件处理数据。Annexin V的阳性细胞被认为是细胞凋亡。通过流式细胞仪用FragEL 荧光检测试剂盒TUNEL法进行检测细胞凋亡。将T淋巴细胞接种于培养皿中密
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度为每孔1.5×10用Hoechst 33,3 42燃料染色培养48小时后可用荧光显微镜观察凋亡细胞。标记的细胞可通过荧光显微镜分析。
2.7流式细胞技术FCM
为了描述T淋巴细胞的表型特征，用PE标记的抗人CD8单克隆抗体，FITC标记的抗人CD4单克隆抗体，PerCP标记的抗人CD3单克隆抗体或者同类型的抗体进行染色。标记后，用FACSCalibur流式细胞仪进行细胞分析并用FlowJo软件处理数据。
2.8前列腺素的产生
放射免疫法（RIA）是用来检测上清中PEG2的水平的。简单的说，就是用抗血清在4度孵育30min。加入标记物后4度培养60min。再加入活性炭：葡聚糖(1%: 0.1%)溶液4度孵育10min。离心15分钟，用液体闪烁计数仪测定上清中氚的活性。
2.9抑制PGE2的产生
在用100um吲哚美辛存在或缺乏的的条件下用流产布鲁氏菌感染T淋巴细胞48小时。然后，用Annexin V/PI检测细胞凋亡。
2.10细胞因子的产生
使用ELI SA法检测上清中人类TNF-a的浓度。
2.11抑制可溶性TNF-a的产生
用人类的TNF-α孵育T淋巴细胞30分钟中和单克隆抗体或者同类型分别做对照。然后用L -Omp19培养48小时，用Annexin V/PI进行细胞凋亡检测分析。
2.12统计分析
试验结果用单因素或双因素方差分析，用GraphPad Prism软件进行邦弗朗尼（Bonferroni）事后检定/检验。数据表示为平均值+标准差或标准误。
3 结果
3.1 流产布鲁氏菌能感染T淋巴细胞但不复制 流产布鲁氏菌寄生于巨噬细胞，会采用不同的免疫逃避策略。为了研究流产布鲁氏菌采用的这些策略是否也使用于其他的免疫细胞，我们决定探讨其对T淋巴细胞的影响。我们首先要确定流产布鲁氏菌感染T淋巴细胞的能力。高度纯化从人体外周血单核细胞负筛选的T淋巴细胞。通过流式细胞仪检测分离纯化的CD3的结果到达98%以上。(图1A和B)。用流产布鲁氏菌2308菌株以不同的感染复数去侵染纯化的T淋巴细胞。用THP-1单核细胞系作为对照，众所周知，它也能被布鲁氏菌感染并在胞内复制。如图1C所示，即使流产布鲁氏菌侵入T淋巴细胞的细菌数大大低于THP-1细胞，然而，动力学分析，我们观察到流产布鲁氏菌不能够在T淋巴细胞内复制（图1D）,这个结果表明B. abortus能够感染T淋巴细胞，但是，这些细胞不能为细菌提供复制的场所。
3.2布鲁氏菌诱导T淋巴细胞的凋亡
接下来我们评估在缺失APCs的情况下流产布鲁氏菌是否能诱导T淋巴细胞的凋亡。为此，纯化MOI感染24h，48h，6天的T淋巴细胞，并用Annexin V-FITC和PI染色进行流式细胞仪分析。2%的PFA用作阳性对照。在24h时，布鲁氏菌不能显著的诱导T淋巴细胞的凋亡（图2A）。然而，我们发现，在48h和6天培养的凋亡细胞的数量明显增加（图2A,B）。用血小板结合抗CD3刺激T淋巴细胞也获得类似的结果，说明流产布鲁氏菌能够在自然条件下激活T淋巴细胞（数据未显示）。为了更进一步的证实结果，我们用TUNEL法检测T淋巴细胞的凋亡。在这些实验中我们用DNase I作为阳性对照。再次证明，B.abortus能诱导TUNEL阳性细胞的数目的剂量依赖性增加（图2C）。为了确定被B. abortus感染的T淋巴细胞的数量，我们通过PBMCs负筛选纯化获得CD4+和CD8+淋巴细胞用不同MOI布鲁氏菌感染这些细胞，在48h，Annexin V/PI对细胞染色和流式细胞仪对其凋亡进行检测。如图2D,E所示，B.abortus诱导CD4+T淋巴细胞的凋亡存在剂量依赖性。另一方面，尽管B. abortus提高诱导CD8+T淋巴细胞的增加，但是不明显。总之，这些结果表明，B. abortus能够诱导T淋巴细胞凋亡不依赖于APCs，CD4+T淋巴细胞相比于CD8+T淋巴细胞更容易被B. abortus感染引起凋亡。
3.3 HKBA也能够诱导T淋巴细胞的凋亡
为了检测活的细菌对于诱导T淋巴细胞的凋亡是否是必需的，我们研究HKBA是否能够也能够引起凋亡。如图3A和B所示，48小时后，活菌和灭活的流产布鲁氏菌都能诱导Annexin V阳性细胞剂量依赖性增加。HKBA诱导的凋亡也是通过Hoechst dye.染色检测的。由HKBA培养的细胞与未刺激的细胞的稠核相比较，结果如图3C所示。这些结果表明，流产布鲁氏菌对T淋巴细胞的影响不依赖于细菌的生存能力，说明T淋巴细胞的凋亡是由细菌的结构元件引起的。
3.4 L-Omp19诱导T淋巴细胞的凋亡
我们分析B. abortus LPS对HKBA诱导T淋巴细胞的凋亡的影响，发现高度纯化的B.abortus LPS不能够诱导T淋巴细胞的凋亡（数据未显示），与所使用的细菌浓度相比。然后，认为细菌的脂蛋白和许多细胞类型中的促凋亡因子类似。我们调查发现，布鲁氏菌的脂蛋白可能是诱导凋亡的结构元件。为了验证这个假设，我们使用重组脂化的omp19（L-Omp19）作为布鲁氏菌的脂蛋白模型。用L-omp19孵育T淋巴细胞，48小时后Annexin V染色。L-omp19能诱导T淋巴细胞剂量依赖性凋亡。另外，T淋巴细胞的凋亡依赖于脂化的L- Omp19，未脂化的Omp19（U- Omp19）不能诱导凋亡（图4A和B）。此外，Pam3Cys，一种合成的脂己肽，模拟了脂蛋白的脂质不分的结构，也能诱导Annexin V阳性细胞的剂量依赖性增加（图4C）。这表明，L-omp19的影响可以扩展到所有流产布鲁氏菌的脂蛋白。用Hoechst dye.染色再次证明了这个结果。用L-omp9表达的核与染色质结合孵育细胞，并用阳性对照PFA孵育形态相似的细胞（图4D）。综上所述，结果表明，B. abortus 的脂蛋白L-O mp19也能够诱导T淋巴细胞的凋亡。